● 摘要
茶树(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)是我国重要的叶用经济植物，具有山茶属植物特有的“花果同现”现象，即从花芽形成到种子成熟，历时一年半左右。在此过程中，漫长的花和果必然会对叶片的生长造成营养竞争。因此，抑制茶树生殖生长是促进茶树营养生长，提高茶树叶片产量和质量的重要途径之一。
茶树作为核心真双子叶植物，花具有典型四轮花器官。雄蕊和雌蕊作为茶树花器官的重要结构，既直接参与有性繁殖，也是果实形成的形态基础。依据现代植物花发育“ABCDE模型”等研究发现，B类和C类基因对花的性别分化和功能发育具有重要作用。因此有必要开展茶树B类和C类MADS-box基因的克隆及其参与生长发育的分子机理研究。研究结果的获得，不但为茶树有性繁殖的遗传学研究提供科学依据，也可为今后通过育种或栽培手段从生殖器官分化的源头上抑制“花果同现”现象，促进茶树叶片生长奠定理论基础。
本研究以陕西省秦巴山区代表性茶树种质‘紫阳槠叶种’(Camellia sinesis cv. Ziyangzhong)为材料，通过同源克隆和RACE技术从已完成分化的茶树花芽中成功获得了两个B类MADS-box同源基因CsGLO1和CsGLO2的cDNA序列全长，并进行了生物信息学预测和系统进化分析；另外，通过拟南芥(Arabidopsis thaliana)异位表达技术对CsGLO1、CsGLO2和CsAG基因进行了功能分析，还利用实时荧光定量PCR、亚细胞定位分析、转录激活活性分析和酵母双杂交技术初步解析了这3个基因在茶树花发育过程中的作用机理。主要结论如下：
1. 利用RT-PCR和RACE技术，以‘紫阳槠叶种’已分化花芽为材料，克隆到两个编码框分别为630bp和627bp的cDNA序列。经BLASTN比对分析和生物信息学预测，这两个茶树基因与GenBank数据库中的山茶(Camellia japonica )、油茶(Camellia oleifera)、猕猴桃(Actinidia chinensis)、拟南芥和金鱼草(Antirrhinum majus)等多个物种的PI/GLO同源基因相似，且都具有保守的MADS域、K域和PI基序。故分别命名为CsGLO1和CsGLO2，GenBank登录号为KJ630568和KJ630569。
2. 对CsGLO1和CsGLO2编码蛋白进行保守结构域分析、亚细胞定位预测、疏水性/亲水性分析、二级结构预测、同源建模三维结构预测和同源性比对分析表明：CsGLO1、CsGLO2属于花发育B类基因，编码MIKC类MADS-box转录因子，且在基因表达调控上可能与其他MADS-box转录因子作用机制相似；系统进化分析显示CsGLO1和CsGLO2属于基部菊类植物PI家族，且PI/GLO同源基因序列相似性与物种亲源关系呈明显正相关，说明PI/GLO转录因子通过保守多肽片段形成基序进而形成相似的高级结构发挥生物学功能。
3. 实时荧光定量PCR结果显示，CsGLO1和CsGLO2主要在花瓣、雄蕊和果实中表达，CsAG则大量出现在雄蕊、心皮和果实中，表现出茶树CsGLO1、CsGLO2和CsAG基因表达模式明显的种属特异性。作为花器官特征基因，CsGLO1和CsGLO2可能作为一个功能单位，在第二轮花器官中高表达共同调控花瓣发育，同时与高表达的CsAG基因共同调控第三轮花器官的发育；而第四轮花器官主要受CsAG基因调控；另外，这3个基因在果实中的高表达还暗示它们可能共同参与茶树果实的生长发育。
4. 拟南芥中的异位表达结果显示，35S::CsGLO1和35S::CsGLO2转基因拟南芥植株表型相似，萼片明显张开且边缘出现白色花瓣状组织，35S::CsAG转基因植株表现早花、叶卷曲、花瓣不同程度缺失、增厚弯曲的萼片上出现柱头和胚珠，表明在花发育过程中茶树CsGLO1、CsGLO2和CsAG基因功能保守且CsGLO1和CsGLO2基因的序列差异并不能导致完全的功能分化，它们可能作为一个功能单位相互冗余地调控茶树的生长发育。
5. 亚细胞定位分析、转录激活活性实验和酵母双杂交实验发现，CsGLO1、CsGLO2和CsAG蛋白是具备核定位能力、但无转录激活活性的转录因子且两两间相互作用能形成异源二聚体。暗示着茶树CsGLO1、CsGLO2和CsAG可能需要通过与其他转录因子结合获取转录调控活性参与花发育调控，通过形成异源二聚体，CsGLO1和CsGLO2可能作为一个功能单位参与茶树的生长发育，同时也反映出CsGLO1和CsGLO2基因具有相似的功能。