● 摘要
抗菌肽（Antimicrobialpeptides，AMPs）是一类存在于多种生物先天免疫系统
中，并由特定基因编码的具有抑菌活性的小分子多肽。在抗生素滥用导致耐药性
问题频发的今天，拥有独特作用机理的两栖类皮肤抗菌肽展现了广泛的应用前景。
抗菌肽Brevinin-2CE是从中国林蛙（Ranachensinensis）皮肤中分离的天然抗
菌肽，全长是37个氨基酸，一级结构为：GLLSVFKGVLKTAGKNVAKNVAGSL
LDQLKCKISGGC。抗菌肽Brevinin-2Ka是从高原林蛙（Ranakukunoris）皮肤中
筛选到的天然抗菌肽，全长为33个氨基酸残基，一级结构是：
GLLSVFKGVLKTAGKHVAGSLLHQLKCKISGGC。这两种抗菌肽拥有Brevinin-2
家族抗菌肽的典型特性，可以抑制常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
本研究以Brevinin-2CE（简称B2CE）和Brevinin-2Ka（简称B2Ka）为模板，
利用生物信息学技术，通过序列截短、单个或多个氨基酸替换，对其序列长度、
二硫键、电荷数、疏水性、两亲性等特征进行改造，并检测改造肽对细菌、红细
胞和真核哺乳动物细胞的活性，研究Brevinin-2家族抗菌肽结构和活性之间的关系。
主要结果如下：
1、利用生物信息学技术分别对B2CE和B2Ka进行了相似的改造，结果为：
通过在合成时不加二硫键或是将半胱氨酸替换为结构相似的丝氨酸，设计了
B2CE-nonDS、B2CE-C31,37S和B2Ka-nonDS、B2Ka-C27,33S；通过截短B2CE
和B2Ka的序列，获得B2CE-N26、B2-N15和B2Ka-N26、B2-N15；分别以B2CE-N26
和B2Ka-N26为模板，通过单个或多个氨基酸替换，设计B2CE-N26-V5K、
B2CE-N26-G14K、B2CE-N26-V5KG14K和B2Ka-N26-V5K、B2Ka-N26-G14K、
B2Ka-N26-V5KG14K，这两组改造肽与模板相比均具有电荷数增加、疏水性降低、
两亲性部分增加的特性；另外，根据螺旋轮设计了具有完全亲疏水面的
B2CE-N26-N16WA18KG23K和B2Ka-N26-H16WA18KG19K；在研究组氨酸和赖
氨酸在序列中的不同作用时，设计了B2Ka-N26-G14KH-K。
2、通过检测最小抑菌浓度（MIC）分析抗菌肽对细菌的抑制作用，结果发现：
与原始肽B2CE和B2Ka相比，缺失二硫键的改造肽对细菌的抑制作用没有变化，
说明二硫键在Brevinin-2抑菌过程中不发挥作用；分别比较B2CE、B2CE-N26、
B2-N15和B2Ka、B2Ka-N26、B2-N15两组抗菌肽的抑菌活性，发现随着Brevinin-2
序列变短，抑菌活性逐渐降低；与B2CE-N26相比，B2CE-N26-V5K的抑菌活性
提高了1-8倍，而与B2Ka-N26相比，B2Ka-N26-V5KG14K的抑菌活性显著地下
II
降，说明适当地提高电荷数和两亲性、降低疏水性，有利于提高抑菌活性；
B2CE-N26-N16WA18KG23K和B2Ka-N26-H16WA18KG19K对检测的菌株均显示
强烈的抑制作用，说明两亲性是Brevinin-2发挥抑菌作用的重要因素；与
B2Ka-N26-G14K相比，B2Ka-N26-G14KH-K的抑菌活性提高2-6倍，说明赖氨酸
相比于组氨酸有利于提高抑菌活性。
3、溶血实验检测结果发现：相比于B2CE，B2CE-C31,37S的溶血活性提高了
2倍，说明二硫键增强抗菌肽对红细胞的伤害；随着序列的截短，红细胞对抗菌肽
敏感度降低；在B2CE-N26和B2Ka-N26的改造中，B2CE-N26-N16WA18KG23K
和B2Ka-N26-H16WA18KG19K展现了极强的溶血活性，说明两亲性是抗菌肽作用
于红细胞的重要因素。
4、利用MTT法检测了抗菌肽对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性，结果发现：
与原始肽B2CE和B2Ka相比，缺失二硫键的改造肽抑肿瘤细胞活性有轻微的降低，
说明二硫键影响抗菌肽抗癌活性的发挥；分别比较B2CE、B2CE-N26、B2-N15和
B2Ka、B2Ka-N26、B2-N15两组抗菌肽的抗癌活性，证明随着抗菌肽序列变短，
细胞对抗菌肽的敏感度降低；以B2CE-N26和B2Ka-N26为模板的改造肽，其抗癌
活性均下降，而B2Ka-N26-H16WA18KG19K的抗癌活性显著提高，证明适度地降
低电荷数、提高疏水性和两亲性有利于抗菌肽发挥抗癌作用；
B2Ka-N26-G14KH-K的抗癌活性相较于B2Ka-N26-G14K提高了4-5倍，说明赖氨
酸相比于组氨酸有利于提高抗癌活性。
在以上工作的基础上，我们又进一步研究了抗菌肽对细菌的作用机制，原子
力显微镜及细菌毒性检测结果证明：抗菌肽作用机制不同于传统抗生素，抗菌肽
能使细胞膜受到破坏，致使细胞裂解，从而起到杀菌作用。
本课题首次以Brevinin-2家族抗菌肽作为模板，设计合成一系列类似物，研究
了该家族的构效关系，并获得具有应用前景的抗菌肽。本研究为抗菌肽分子改造、
开发新型抗菌制剂奠定了基础。