题目：丹参GGPP合酶基因的克隆及表达分析

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国一种药用植物，以根及根茎入药，具有活血调经、祛癖生新、镇静安神、凉血消痈、消肿止痛等功效，被广泛应用于冠心病、脑血管病、肝炎、肝硬化、慢性肾衰竭、月经不调和心烦不眠等病症。丹参的有效成分可分为两大类：一类是水溶性酚酸类物质，包括丹酚酸、迷迭香酸、迷迭香酸甲酯和原儿茶醛等；另一类是脂溶性二萜醌类化合物，包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮和二氢丹参酮等。
丹参酮类物质多属于二萜醌类化合物。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPPS）是高等植物二萜类物质合成的限速酶之一，调控着代谢分支点前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate, GGPP）向二萜类物质的合成。本研究采用简并引物和染色体步移法克隆了丹参中GGPP合酶基因（命名为：SmGGPPS），对该基因的序列以及启动子区域的调控信息进行了生物信息学分析，应用实时定量PCR方法，对该基因在不同器官、不同环境因子影响下的表达情况进行了探讨；采用可上调SmGGPPS基因表达的因子处理丹参植株，并用HPLC技术检测了在这些因子影响下丹参二萜类物质合成的变化。本研究为进一步阐明丹参二萜类化合物(丹参酮类)的生物合成机制及其调控提供一定的资料。
主要研究结果如下：
1.利用简并性引物并结合染色体步移法从丹参DNA水平和cDNA水平克隆了丹参牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶基因（SmGGPPS）。基因全长2758 bp，包含1个内含子序列；开放读码框1086 bp，编码361个氨基酸（氨基酸序列命名为：SmGGPPS）。SmGGPPS 在核酸水平和编码氨基酸水平与已报道的其它植物中同源的GGPP合酶基因都有很高的一致性（达64%以上）。
2. SmGGPPS编码氨基酸含有一个转异戊烯基焦磷酸合酶（Trans-isoprenyl diphosphate synthases）结构域，属于转异戊烯基焦磷酸合酶蛋白家族成员。具有GGPP合酶家族的两个富含天冬氨酸的特征性序列：DDXXXXD和DDXXD。生物信息学分析显示该多肽序列N端含有叶绿体转运肽片段，是亲水的叶绿体蛋白，螺旋结构是其主要高级结构单元。
3.丹参SmGGPPS基因5’端侧翼序列（1095 bp片段），除包含启动子核心元件和组织特异性表达相关作用元件外，还有与损伤、干旱、热、GA、SA、ABA和病原菌等诱导相关的顺式作用元件。推测SmGGPPS基因的表达可能受到光、高温、病原菌浸染、损伤、植物激素（GA、ABA和SA）、盐溶液等因子的调控。
4.基因表达分析显示，丹参SmGGPPS基因主要在叶中特异表达；黑暗、高温、病原菌、机械损伤，盐溶液（200 mM NaCl溶液）、赤霉素（50 mM GA3）、脱落酸（100 mM ABA）和水杨酸(5 mM SA )等几种因子可诱导该基因的表达上调。
5. NaCl溶液（500 mM）、高温、GA3（50 mM）和SA（10 mM）等四种因子可促进丹参中丹参酮类化合物成分的积累，其中SA（10 mM）的效应最高，约是对照组的3倍；ABA（100 mM）和黑暗虽然可以诱导丹参GGPP合酶基因表达上调，但对丹参酮类化合物积累的促进效应不明显。