题目：基于腺病毒的严密型Tet-on诱导调控表达载体的构建及其体外应用研究

???????????????? 摘要
肿瘤是目前对人类威胁最严重的疾病之一，传统的手术，化疗及放疗等治疗手段都存在一定的局限性，同时传统疗法对人体正常细胞有很大的伤害。基因治疗是目前肿瘤治疗中的一种新的治疗手段，通过使用对肿瘤具有特异的杀伤和抑制的治疗基因，不仅可以降低病毒基因治疗的副作用，同时还可以提高肿瘤基因治疗的效果。


安全有效的基因转导载体是基因治疗的关键，腺病毒载体具有滴度高、容量大、不整合到染色体中、对人致病性低、可同时表达多个基因等特点，因此在肿瘤基因治疗研究方面成为最具有应用前景的病毒载体之一。


肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor
necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）属于肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）超家族成员。TRAIL具有选择性细胞毒作用，它可以特异结合肿瘤细胞表面高表达的死亡受体4和死亡受体5（Death receptor 4,
Death receptor 5）从而特异性的诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无明显影响。因此在肿瘤基因治疗领域受到了极大关注。


TRAIL作为治疗基因时仍然能表现出对正常细胞的毒性，在制备携带TRAIL的病毒时，由于TRAIL对宿主细胞的影响会造成病毒颗粒的滴度和活力下降，所以实现对治疗基因TRAIL的可调控表达对获得高活力的病毒将起到非常关键的作用。


基因的调控表达可以使基因功能的研究变得更为细致。此外，在基因治疗过程中任何外源基因的过度或不适当的表达都会影响到基因治疗的效果。因此实施对基因表达的调控，无论是在基因功能研究方面还是在疾病的基因治疗研究中都具有十分重要的意义及实际应用价值。四环素(tetracycline,
Tet)真核细胞基因调控表达系统利用Tet及其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。随着人们对该系统的不断改进，使这种诱导表达系统具有严密、高效、可控性强及表达泄露小等优点。Tet系统已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗研究，为疾病的基因治疗提供了安全的体系。目前研究人员发展了多种类型的Tet调控系统，根据其表达特点可以归为两大类：抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。Tet-off系统特点是在诱导剂存在时，系统关闭，基因不表达；Tet-on系统则相反，在诱导剂存在时，系统开启，基因表达。但现有的Tet-on系统依然存在本底渗漏和调控蛋白过量表达对细胞的干扰作用；同时以往Tet-on系统的构建需要调控载体和反应载体两个质粒，因此降低了该系统的构建效率。本研究通过使用一个载体建立一种低本底渗漏和高效诱导的Tet-on系统，并将之应用于腺病毒载体的构建，实现对外源基因TRAIL的调控表达，使获得的携带TRAIL的腺病毒具有更好的活力，为肿瘤基因治疗提供有力的工具。


为了探讨基于腺病毒载体的严密型Tet-on诱导表达系统的调控能力及其体外应用效果。本课题主要进行了以下四个方面的研究：


（1）Tet-on系统需要各个基因，包括rtTA，rtTA2S-M2，TRE-PminCMV，Tight-PminCMV及TetR-KRAB基因的克隆；


（2）严密型Tet-on载体的构建、测试及最优载体的获得；


（3）严密型Tet-on调控表达载体特性的测定；


（4）严密型Tet-on调控表达sTRAIL的新型腺病毒载体构建及其体外生物活性检测。


本研究主要实验方法和结果如下：


（1）目的基因克隆：通过分子生物学手段克隆rtTA，rtTA2S-M2，
TRE-PminCMV及Tight-PminCMV基因，并经酶切和测序加以鉴定。。


（2）严密型Tet-on诱导表达载体的构建：通过限制性内切酶位点，将各个基因按设计顺序分别连接到载体中，得到的载体分别命名为pAd5-CMV-rtTA-TRE-PminCMV，pAd5-CMV-rtTA2S-M2-TRE-PminCMV，pAd5-Bi-Tet-on及pAd5-KRAB-Bi-Tet-on。


（3）严密型Tet-on诱导表达载体的性能测试：将报告基因增强绿色荧光蛋白（eGFP）连入pAd5-CMV-rtTA-TRE-PminCMV，pAd5-CMV-rtTA2S-M2-TRE-PminCMV，pAd5-Bi-Tet-on及pAd5-KRAB-Bi-Tet-on中，磷酸钙法转染HEK293细胞，经诱导后荧光显微镜下观察诱导效果和本底渗漏情况，选出3种性能较好的载体；然后将萤火虫萤光素酶基因（Luciferase）连入以上筛选出的3种载体pAd5-CMV-rtTA2S-M2-TRE-PminCMV，pAd5-Bi-Tet-on及pAd5-KRAB-Bi-Tet-on中，利用脂质体LipofectamineTM
2000转染HEK293细胞，测定各组诱导前和诱导后标准萤光素酶活力值的差异，定量选择出本底最少，诱导强度最大的载体pAd5-KRAB-Bi-Tet-on。


（4）严密型载体pAd5-KRAB-Bi-Tet-on的诱导特性曲线测定：将萤光素酶基因（Luciferase）连入载体pAd5-KRAB-Bi-Tet-on中，利用脂质体LipofectamineTM
2000转染HEK293细胞，加入诱导剂强力霉素（Doxycycline,
Dox），每间隔4 h时间测定标准萤光素酶活力值，绘制萤光素酶活力值对时间的曲线图，得知40 h后有最大诱导强度；同时测定48 h后不同诱导药物浓度下，pAd5-KRAB-Bi-Tet-on的药物剂量曲线，得知2000ng/ml的Dox有最大诱导效果；另外在加药3天后撤除药物，每天测定标准萤光素酶活力值，得到pAd5-KRAB-Bi-Tet-on的关闭曲线，得知24 h诱导表达量下降至接近最大表达量的10%；采用Western
Blot在蛋白水平检测pAd5-KRAB-Bi-Tet-on对目的基因的本底及诱导后表达量。




（5）携带sTRAIL的严密型Tet-on腺病毒Ad5-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL的构建及病毒制备：采用分子生物学手段构建腺病毒E1
shuttle载体pAd5-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL经酶切鉴定载体构建正确。PacⅠ分别线性化pAd5-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL和腺病毒骨架载体pAd5-E3-eGFP-backbone，使用磷酸钙法共转染入HEK293细胞进行病毒包装、扩增后，经氯化铯密度梯度离心法纯化，制备得诱导表达sTRAIL的腺病毒载体Ad5-E1-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL-E3-eGFP。经过与非诱导表达sTRAIL的腺病毒载体在滴度和活力方面的测试比较，证实诱导型腺病毒具有更高滴度与活力的优势。


（6）携带sTRAIL的严密型Tet-on腺病毒Ad5-E1-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL-E3-eGFP的体外活性检测：MTT法检测腺病毒Ad5-E1-KRAB-Bi-Tet-on-sTRAIL-E3-eGFP在诱导和非诱导情况下对SW480细胞的生长抑制。


综上所述，本课题获得一种新型Tet-on诱导表达系统，经过报告基因测试表明，该系统具有只需一个载体即可完成对基因表达的调控、严密性好及诱导倍数高的优点；在此基础上，构建了携带有sTRAIL基因的Tet-on腺病毒载体，经过报告基因测试证明该病毒载体在滴度和活力上具有明显的优势；通过该病毒载体对肿瘤细胞杀伤实验的研究表明，在诱导状态下该病毒对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用，为肿瘤基因治疗研究奠定了基础。