● 摘要
氯过氧化物酶(Chloroperoxidase，简称CPO)因具有独特的活性中心结构而具有多种催化性能及广泛的底物适应性，尤其引人注目的是其对底物的手性识别功能，如通过手性磺化氧化等方法合成手性药物中间体或手性药物，是一种极具产业化应用潜力的生物催化剂。
用手性化学试剂做催化剂合成手性莫达非尼时存在合成条件较为苛刻、催化剂不易制备、对映选择性不高等问题，本论文用CPO做催化剂TBHP/H2O2做氧化剂，以二苯甲基硫代乙酰胺为底物，研究了CPO催化定向合成R-型莫达非尼的合成方法及主要影响因素；并通过各种有机添加剂：咪唑类离子液体（溴化1-乙基-3-甲基咪唑（[EMIM][Br]）、溴化1-丙基-3-甲基咪唑（[PMIM] [Br]）、溴化1-丁基-3-甲基咪唑（[BMIM][Br]）、溴化1-戊基-3-甲基咪唑（[AMIM][Br]），季铵盐类离子液体（四甲基溴化铵（TMABr）、四乙基溴化铵（TEABr）、四丙基溴化铵（TPABr）、四丁基溴化铵（TBABr）），多羟基化合物（甘油、PEG400、PEG600），常用有机溶剂（乙醇(CH3CH2OH)、乙腈（CH3CN）、丙酮(CH3COCH3)、四氢呋喃（THF）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲亚砜（DMSO））提高疏水性底物的溶解性及亲水CPO的稳定性，提高反应的产率。同时通过紫外、圆二色光谱等谱学分析在分子水平上探讨了添加剂的引入对CPO的催化活性增敏机理。为了避免H2O2的浓度较大时对CPO活性的抑制作用，本文还采用氯过氧化物酶-葡萄糖氧化酶双酶偶联体系。在线产生H2O2与外部人工加入方式进行比较，研究不同添加策略对产物产率的影响，主要结果如下：
1. CPO催化二苯甲基硫代乙酰胺的主产物为R-莫达非尼，考察了有添加剂及没有添加剂时对产率的影响，体系主要受添加剂类型、pH值、氧化剂种类及用量、酶用量、反应时间等因素的影响。当采用TBHP为氧化剂且TBHP：底物=1.5：1，pH为5.5，引入离子液体1-乙基-3-甲基咪唑([EMIM][Br])为共溶剂时对CPO的酶促反应的增敏效果最好：最佳条件下，产物和对映选择性分别为40.8%和96.7%.酶促反应动力学Km的减小及Kcat/Km的增大表明引入共溶剂时CPO对底物的亲和力及对底物的识别专一性得到改善，转化常数增大，产物产率增加。紫外及圆二色谱表明共溶剂在体系中有优化酶分子结构、相转移催化等多种功效。
2. GOD(葡萄糖氧化酶)氧化葡萄糖在线产生H2O2可使H2O2源源不断地缓释于体系中，避免了H2O2一次性加入量太少时不够用，太多时又会对CPO活性产生抑制。本文考察了体系中最佳pH值下、H2O2的缓释速率与投放时间的协同作用，匹配了最佳反应条件。与单酶体系传统的人工外部分批加入H2O2的结果进行比较，一定时间间隔内，由于H2O2的缓释，可以使CPO在更长的时间内保持催化活性，相同条件下，莫达非尼的产率由单酶体系的32.4%提高到双酶体系的36.4%。