● 摘要
血小板膜糖蛋白GPIbα 受体膜外部份含VWF的结合位点。病理情况下，血小板通过GPIbα 与血管内皮下或血浆中血管性假性血友病因子VWF 进行结合，这种结合使得血小板以滚动方式粘附在损伤血管表面，与此同时，启动血小板细胞信号转导机制，导致血小板表面另一受体GPIIb/IIIa 的活化，GPIIb/IIIa与血浆中纤维蛋白原和VWF 结合，最终导致血小板相互聚集成团，形成血小板血栓。血小板表面GPIbα与VWF 的结合是整个血小板血栓形成的起始关键过程。研究GPIbα 与VWF 的结合对血小板的调控作用，发现GPIbα 与VWF 的结合不仅诱导血小板活化、形成血栓，而且诱导血小板发生凋亡，初步研究提示这两条信号通路相对独立存在。但是，血小板凋亡和活化信号通路如何被激活，其信号通路中哪些蛋白参与调控信号通路以及如何调控等等，还尚未见报道。
为了探明血小板凋亡和活化的信号转导机制以及之间的关系，本文着重通过研究目前已知在血小板活化信号通路中的三个重要蛋白：蛋白激酶A(cyclic-AMP Dependent Protein Kinase A，PKA)，环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)和蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)在血小板凋亡中的作用，利用这三种蛋白的蛋白抑制剂或激活剂，探明血小板凋亡和活化的发生机制并探讨其之间关系。
实验方法是，取健康志愿者外周静脉血，分离血小板。选择PKA，COX，PKC等多种信号通路蛋白抑制剂或激活剂，通过与洗涤血小板在不同的时间和浓度作用下共同孵育，应用流式细胞术和Western blot等实验技术，检测其对血小板指标，如：线粒体膜电位 (Mitochondrial Transmembrane Potential，ΔΨm) 变化；血小板胞内蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinylaspartatespecificproteinase，Caspase)的活化；B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B Cell Lymphoma/Lewkmia-2，Bcl-2)家族的变化；血小板细胞膜磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的外翻；血小板形态的变化和血小板P-选择素的变化以及血小板聚集程度变化等。论文的主要实验结果如下：
(1) PKA抑制剂H89可以计量依赖的(25μM，50μM，100μM)诱导血小板出现△Ψm去极化，Caspase-3活化，PS外翻和血小板皱缩的现象，但是H89不会诱导血小板出现血小板活化。通过RNA干扰(RNA Interference，RNAi)技术，用PKA催化亚基α(PKA Catalytic Subunit-α，PKACα)的小干扰核糖核酸(Small Interfering RNA，siRNA)与血小板无菌条件下共孵育48小时后，抑制PKACα的功能后，出现血小板凋亡的指标变化和血小板对诱导剂出现低活化反应，而对照组RNA干扰后的血小板未出现相同的实验现象。反应氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine，NAC)可以明显逆转H89引起的血小板△Ψm去极化、PS外翻和血小板皱缩的现象；
(2) 阿司匹林(Aspirin，ASA)和吲哚美辛(Indomethacin)是研究COX功能的常用试剂，均对COX有抑制作用。我们通过将血小板与不同浓度的ASA(2.5mM，5mM，10mM， 20mM)和吲哚美辛(50μM，100μM，200μM)共孵育后，检测血小板凋亡和活化指标的变化。研究结果显示，ASA可以浓度梯度和时间梯度诱导血小板出现△Ψm去极化、PS外翻、Caspase-3活化、血小板皱缩等血小板凋亡现象。用不可逆的Caspase广普抑制剂Z-VAD-FMK，不仅可以抑制血小板内Caspase-3的活化，而且可以有效的抑制血小板△Ψm的功能改变和血小板形态的改变。吲哚美辛不能诱导血小板出现△Ψm去极化改变和PS外翻的现象；
(3) 正常人洗涤血小板与0.1µM的PKC激活剂佛波酯(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate，PMA)或溶剂二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)在37°C分别孵育30分钟、45分钟、60分钟、75分钟和90分钟后，加入TMRE(100 nM)避光孵育20分钟。流式细胞仪检测发现，0.1μM的PMA时间依赖性诱导血小板出现△ψm去极化；血小板与PMA(0.1µM和1µM)或DMSO在37°C孵育2小时后，Western blot检测显示，PMA剂量依赖性诱导Caspase-3产生17 kDa活化片段，提示PKC激活剂PMA呈浓度依赖性的诱导血小板内caspase-3发生活化裂解；
为了更好的明确PKC与血小板凋亡之间的关系，我们还检测了PKC抑制后血小板内△ψm的变化和PS的暴露情况，结果显示PKC广谱性抑制剂星形孢菌素(Staurosporine，STS)可以明显的诱导血小板出现△Ψm去极化、PS外翻、血小板线粒体内细胞色素C的释放、Caspase-8和-9的活化以及p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 Mitogen-Activated Protein Kinase，p38 MAPK)活化的现象，用SB203580抑制p38 MAPK的活性可以有效的抑制STS诱导的血小板凋亡现象；而PKC特异性抑制剂Gö 6983不能诱导血小板出现△ψm去极化和PS外翻的变化。STS和Gö 6983均不能诱导血小板P-选择素在细胞膜上表达；
结论：本研究证明PKA参与调控静息状态下的血小板稳态，抑制PKA活性会诱导血小板出现凋亡现象，其主要机制可能是通过打破活性氧ROS产生及清除的平衡，使过量的ROS在血小板内积累，而引发血小板发生凋亡；ASA诱导的血小板凋亡现象是COX非依赖的，COX不参与调控血小板凋亡，可能主要参与调控血小板活化现象；通过对比PKC激活剂和抑制剂对血小板作用的影响，证明PKC参与调控活化血小板的凋亡信号通路。通过对这血小板内这三个重要蛋白的研究发现，PKA和PKC参与调控不同状态下血小板的凋亡过程，且其调控机制不同。本研究结果不仅探明不同的调控蛋白在血小板参与的止、凝血过程中起到负调控作用机制；并且对研究血小板活化的负调控功能及其探讨相关疾病的发病机理具有重要意义。