● 摘要
白血病（Leukemia），又称“血癌”， 是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病，危害人类健康。据调查，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。目前临床上，白血病的治疗主要有手术治疗、化学治疗、放射治疗、标靶治疗及中药治疗等方法，对白血病的治疗、延长患者生存期起到了一定的作用，但是这些方法都有其不足之处，甚至存在较强的毒副作用。基于白血病对人类健康的严重威胁和白血病治疗研究的现状，探索一种疗效显著、靶向性强、安全性好的抗白血病方法仍是当今生物医学领域亟待解决的重大问题。
声动力学疗法（Sonodynamic therapy, SDT）是在光动力学疗法（Photodynamic therapy, PDT）的基础上发展起来的一种肿瘤治疗的新方法，由Umeumra S等人于1989年首次提出。超声具有良好的组织穿透性，能够穿透深层组织，聚焦于肿瘤病灶，激活特异性富集于肿瘤组织中的声敏剂分子，在有效地杀伤肿瘤组织的同时，降低对周围正常组织的损伤，从而实现靶向性强、安全性高的非侵入式治疗。近年来，本课题组围绕SDT开展了大量的研究工作，发现低强度超声联合血卟啉、原卟啉Ⅸ对肿瘤细胞具有显著的协同杀伤效应。 然而，由于SDT对肿瘤细胞的杀伤与超声参数、声敏剂类型，以及研究所选择的细胞模型密切相关，迄今为止，SDT杀伤肿瘤细胞的具体作用机制仍未阐明。
本论文以国家自然科学基金项目“声动力学疗法介导白血病细胞的死亡模式及其机制研究 10904087”为依托，采用频率为1.0 MHz的聚焦超声结合浓度为2 μg/ml的PpⅨ作用于离体培养的人白血病K562细胞，通过检测声动力学处理后细胞的形态学变化、凋亡相关的生理生化指标的变化及其相关的影响因素，初步探讨声动力学疗法诱导K562细胞凋亡的机理。目前取得的实验结果如下：
1、流式细胞术定量分析结果显示PpⅨ在K562细胞中的富集量随着孵育时间的延长而增加，在4 h时达到最大，随后趋于稳定。
2、采用MTT法检测发现，PpⅨ对K562细胞的毒性作用具有明显的剂量依赖性；超声对K562细胞的损伤具有显著的强度依赖性；而超声结合PpⅨ对K562细胞的增殖抑制效应较单纯PpⅨ和单纯超声明显，并随着处理后培养时间的延长而持续下降。扫描电镜结果显示，与单纯PpⅨ和单纯超声相比，SDT处理可造成K562细胞显著的膜损伤。
3、DAPI染色观察发现，SDT处理后，K562细胞核表现出细胞核肿胀、染色质凝集等凋亡性变化，而单纯PpⅨ和单纯超声对K562细胞核没有明显的影响。Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP的表达发现，SDT处理后4h，细胞中Caspase-3和PARP的剪切片段的表达量较对照组明显增加，提示SDT能够诱导K562细胞发生凋亡。
4、通过激光扫描共聚焦显微镜观察发现PpⅨ主要定位在K562细胞的线粒体，提示线粒体可能是超声联合PpⅨ杀伤K562细胞的重要靶标。
5、流式细胞仪检测结果显示，SDT可引起K562细胞线粒体膜电位明显下降；此外，凋亡相关蛋白Bax转定位至线粒体，Caspase-9被剪切活化；提示SDT处理激活K562细胞中的线粒体凋亡通路，可能是SDT诱导K562细胞凋亡的原因之一。
6、流式细胞仪检测发现，SDT可引起K562细胞中活性氧水平明显升高；激光扫描共聚焦显微镜观察发现SDT处理后，活性氧弥散分布于K562细胞中，包括线粒体。活性氧的抑制剂NAC能够减轻SDT对K562细胞核的损伤，降低SDT对K562细胞的杀伤效应。提示活性氧可能参与了SDT杀伤K562细胞的过程。