● 摘要
骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）取自自体骨髓，免疫排斥反应小，增殖能力强，在一定的条件下可以诱导分化为成骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、软骨细胞和脂肪细胞等，为各种组织器官的修复和重建提供良好的细胞来源。能否实现对干细胞的分化调控是决定干细胞未来应用的关键之一。影响干细胞生物活性的因素主要包括化学因素和物理因素，一般都认为化学因素传递信号组成的网络调控干细胞的增殖分化，近年来，许多研究表明物理和生物材料微环境对干细胞也有重要的影响，如力学因素可以影响BMSCs的增殖、周期、骨架，并影响化学因素存在条件下的向成骨细胞、软骨细胞和平滑肌细胞等方向的分化。但是，力学因素对BMSCs向内皮细胞、心肌细胞分化的影响尚不清楚。在体内，动脉血管内皮细胞持续暴露于周期性脉动流剪切应力刺激下，心肌细胞体内受到心肌收缩舒张过程中产生的周期性牵张应力。此外，随着植介入医疗器械的广泛使用，植入材料对组织细胞的改重建有重要的影响，纳米级羟基磷灰石（nano-size of hydroxyapatite, n-HA）比微米级羟基磷灰石（micro-size of hydroxyapatite, μ-HA）材料具有更好的生物活性、相容性、降解性和骨传导性，目前n-HA和μ-HA对BMSCs向成骨细胞分化的影响尚不清楚。本文研究了定常层流剪切应力、近生理脉动流剪切应力对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells, rBMSCs）向内皮细胞方向分化的影响，研究了周期性牵张应变对rBMSCs向心肌细胞方向分化的影响，以及μ-HA和n-HA对rBMSCs向成骨细胞方向分化的影响。本文的主要研究内容和结果如下：（1）rBMSCs的分离、培养和鉴定。采用Percoll密度梯度离心结合反复贴壁筛选，并差速消化传代方法分离培养rBMSCs。培养的细胞贴壁生长，成纤维细胞状；流式细胞仪检测细胞表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD106 和 CD166等间充质细胞表面标志，不表达造血干细胞系表面标志CD34、白细胞表面抗原CD45和HLA-DR；细胞有很强的扩增潜能；体外可以诱导细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。本实验所分离到的细胞是rBMSCs。（2）定常层流剪切应力及近生理脉动流剪切应力对rBMSCs向内皮细胞分化的影响。利用平行平板流动腔提供定常层流，对rBMSCs加载15 dyne/cm2剪切应力，作用24 h，能较好地诱导rBMSCs向内皮细胞方向分化；不同大小的定常层流剪切应力诱导rBMSCs向不同的力敏感细胞方向分化（15 dyne/cm2促进rBMSCs向内皮细胞分化，10 dyne/cm2促进rBMSCs向心肌细胞分化，5 dyne/cm2促进rBMSCs向成骨细胞分化）；利用本实验室自主研制的近生理脉动流细胞力学实验系统，发现近生理脉动流剪切应力比定常层流剪切应力可以更好地诱导rBMSCs向内皮细胞方向分化；近生理脉动流剪切应力或定常层流剪切应力与血管内皮生长因子联合作用比任一因素单独作用可以更好地诱导rBMSCs向内皮细胞方向分化。（3）周期性牵张应变对rBMSCs向心肌细胞分化的影响。利用本实验室自主研制的多模态组织工程反应器，对rBMSCs加载不同大小、频率、时间的周期性牵张应变，结果表明诱导rBMSCs向心肌细胞方向分化的最适条件是：10%牵张应变，1Hz牵张频率，24 h周期性牵张作用；通过比较周期性牵张应变和定常层流剪切应力对rBMSCs向心肌细胞分化的影响，结果表明一定的周期性牵张应变比定常层流剪切应力可以更好地诱导rBMSCs向心肌细胞方向分化；另外，周期性牵张应变或定常层流剪切应力与5氮胞苷联合作用比任一因素单独作用可以更好地诱导rBMSCs向心肌细胞方向分化。（4）μ-HA和n-HA对rBMSCs向成骨细胞分化的影响的比较性研究。采用微波化学合成的方法制备μ-HA，采用化学沉淀的方法制备n-HA；μ-HA和n-HA均可以诱导rBMSCs向成骨细胞分化；n-HA比μ-HA诱导rBMSCs表达更多的成骨细胞相关因子，最适浓度是200μg/mL；n-HA和化学因素的联合作用更好地诱导rBMSCs向成骨细胞方向分化。BMSCs在再生医学中有重要的应用前景，认识BMSCs对环境因素的反应非常必要。本文研究了力学加载及生物材料微环境对rBMSCs分化的影响，有助于丰富干细胞分化调控理论，探索体外组织工程种子细胞的定向诱导分化的新途径。探讨不同因素联合作用对BMSCs分化的影响，增加BMSCs定向分化的效率，为组织工程种子细胞的研究应用和生物反应器的合理设计提供实验依据和理论基础。