● 摘要
阿魏酸是植物界常见的一种酚酸，具有抗氧化、抗衰老、抗动脉硬化等功效。易于被人体吸收，且不会在体内积累，目前主要应用于医药、食品等领域，是一种安全性极高的药物，具有极大的应用前景。谷维素是一种阿魏酸和植物甾醇结合酯，是目前制备阿魏酸的主要原料。
现阶段工业化生产阿魏酸的主要方法是利用高浓度碱水解谷维素得到阿魏酸。但这种方法能耗大，生产成本高，且易造成环境污染。考虑到酶法水解反应条件温和，无污染，产物易分离的特性，可尝试利用酶水解谷维素制取阿魏酸，这也是未来研究的重点。
本文主要研究结果如下：
1．本课题在现有工业化利用谷维素制备阿魏酸方法的基础上，将单一的氢氧化钠体系改为氢氧化钠-异丙醇体系，使用响应曲面法对其工艺进行优化。得到最优工艺为：水解时间12.5h，碱浓度12%，底物浓度6.5mg/mL，阿魏酸得率为71.33%。对阿魏酸得率的影响因素依次为：底物浓度＞水解时间＞碱浓度。与其他化学法水解谷维素制取阿魏酸的试验相比，在此工艺条件下制取阿魏酸，工艺简单，不仅提取率较高，而且所使用的碱浓度更低。
2．在摇瓶培养条件下，对解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）进行发酵试验，其发酵液酶活为1060 U/mL（发酵120h时，碱滴定法测定），制得的全脂肪酶粉酶活为 105000 U/g。应用制得的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）全脂肪酶粉催化谷维素的水解反应，参照文献，选取多个反应体系，最后确定的酶解反应体系为： pH7.4 Tris-HCL（包含7.5mM牛黄胆酸铵和0.1M 氯化钠），0.1M pH6.0磷酸钠缓冲液（包含脂肪酶10mg和3M氯化钠）。在此工艺条件下，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）全脂肪酶粉对阿魏酸的得率为3.09% ，结果说明，解脂耶氏酵母全脂肪酶对谷维素有一定的水解作用。
3．以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为材料，克隆获得lip2脂肪酶基因，并将lip2脂肪酶基因整合进毕赤酵母GS115基因组中成功表达，得到毕赤酵母GS115/lip2重组子。在摇瓶培养条件下，对毕赤酵母GS115/lip2重组子进行发酵试验。得到毕赤酵母GS115/lip2重组子发酵液酶活为780 U/ml(发酵120h时，碱滴定法测定)，制得的脂肪酶粉酶活为 70100 U/g。应用制得的毕赤酵母GS115/lip2重组子脂肪酶粉催化谷维素的水解反应，阿魏酸的得率为2.01%，结果表明，单一的解脂耶氏酵母lip2脂肪酶对谷维素也有一定的水解作用。
通过对比碱法与酶法水解谷维素制取阿魏酸的结果，本课题发现：虽然酶法制备阿魏酸的得率明显低于化学法，但酶法反应条件温和，生产成本低，对环境污染小，是未来利用谷维素制备阿魏酸绿色化生产工艺的研究重点。