● 摘要
分泌型IgA(SIgA)是人体粘膜表面的主要抗体，是抵御病原体侵袭的第一道免疫防线。目前为止尚没有人尝试在动物呼吸道或消化道使用分泌型IgA 阻断H5N1病毒的感染。由于禽流感主要是通过呼吸道或消化道感染，因此，呼吸道SIgA或消化道SIgA在病毒感染的最早期阶段产生最有效的保护效果。本次研究选择在中国仓鼠的卵巢（chinese hamster ovary, CHO）细胞中表达嵌合SIgA抗体，此嵌和抗体是抗H5N1病毒的具有中和活性的抗体，并且尝试了研究预防性分泌型IgA类抗体。
从分泌抗禽流感的H5N1-HA单克隆抗体的杂交瘤细胞HA8中提取总RNA，应用RT-PCR方法对轻链可变区基因和重链可变区基因进行扩增， 将PCR产物克隆到pMD18-T载体上，进行基因测序并且进行基因序列的分析，经过分析，此抗体为小鼠的免疫球蛋白基因，轻链可变区共有393个碱基， V段为IgKVⅢ家族，J 段为IgKJⅠ家族，重链可变区共有414个碱基，其中，重链可变区属于IgHVⅠ家族， J段来自IgHVⅡ家族，D段来自IgHVⅣ家族；通过重叠延伸PCR技术，将鼠源重链可变区基因与人的IGHA2基因进行拼接，鼠的轻链可变区基因与人的CK进行连接，成功构建完成了人/鼠嵌合IgA抗体的基因。将人/鼠嵌合IgA抗体轻、重链基因分别克隆到表达载体pEF-dhfr-Neo载体中，此载体是以新霉素抗性基因(NEO) 和二氢叶酸还原酶基因(DHFR)两者为双筛选标记，以CMV早期启动子引导的。
用已经成功构建的表达质粒pEF-IGK8和pEF-IGHA8转染CHO/dhfr-细胞，经过选择性培养基（无次黄嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM）进行筛选，然后挑取阳性克隆，利用MTX加压的方法，进一步加压来提高表达量。然后对经过加压的细胞株扩大培养，然后纯化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗体，用亲和层析柱（具有专一性结合人源抗体Kappa链的蛋白）从含有牛血清CHO细胞的培养上清中进行纯化嵌合IgA抗体，并对其免疫学特性进行了分析。最后，将构建完成的表达质粒pEF-IGHA8，pEF-IGK8瞬时共转染CHO/dhfr-细胞，经过培养48-72小时，细胞上清使用ELISA方法对SIgA抗体各组分的分泌情况进行检测。
总之，本研究成功且完整的克隆了抗H5N1病毒的中和性单抗可变区基因，并且对其可变区基因的序列进行了胚系基因片段的分析；成功构建了完整人-鼠嵌合IgA抗体的基因；成功的构建了重组SIgA的相关的基因的表达载体；最后，通过对CHO细胞的转染，初步得到了嵌合的IgA抗体和SIgA抗体。