● 摘要
随着工农业的快速发展，水域环境中的内分泌干扰物含量在持续增加。酚类环境污染物的化学性质稳定、不易降解，进入动物体后可产生性激素效应，对动物幼体的性腺分化及成体生殖、内分泌系统产生干扰。辛基酚（4-tert-Octylphenol，OP）可通过扰乱内分泌功能而导致动物生殖功能异常，其机制仍不清楚。类固醇激素合成急性调节蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）和芳香化酶（Cytochrome P450 Aromatase，P450arom）是类固醇激素合成中的关键酶，在两栖动物，OP通过干扰这两种酶的活性而对性激素合成产生的影响，仍需要大量实验证实。本实验以中国林蛙（Rana chensinensis）为研究对象，探讨OP对中国林蛙精巢间质细胞中StAR和P450arom表达的影响，为揭示酚类物质对动物内分泌和生殖影响的机制提供实验证据，并有助于对两栖动物生活环境的保护和治理进行评价和预测。
本实验将成体雄性中国林蛙暴露于10-6、10-7、10-8mol/L OP水体中持续10d、20d、30d、40d；并设10-7、10-8 mol/L 17β-雌二醇（17β-Estradiol，E2）为阳性对照，取其精巢组织，通过原位杂交、实时定量PCR的方法检测StAR和P450arom的编码基因CYP19（Cytochrome p19）mRNA表达，利用免疫组织化学方法，检测StAR和P450arom的蛋白表达。实验结果和结论如下：
1. 总RNA提取之后，测定其OD260/ OD280比值在1.8和2.0之间，电泳检测出现28S、18S、5S 三条带，说明所提取的RNA纯度合格。用RT-PCR成功扩增出115bp的中国林蛙β-actin cDNA序列。
2. 用RT-PCR成功扩增了273bp 的StAR cDNA序列（序列号HQ 610610），用该片段序列合成RNA探针进行原位杂交，检测OP暴露组和对照组中国林蛙精巢中StAR mRNA的表达，结果显示StAR mRNA阳性反应主要存在于间质细胞，生精细胞和支持细胞中较少。免疫组织化学检测StAR蛋白的组织细胞定位与原位杂交结果基本一致。
实时定量PCR检测StAR mRNA的表达水平，在10-6mol/L OP组，随着暴露时间的延长，StAR mRNA表达量逐渐增高，暴露20 d，StAR mRNA的表达量显著增高，暴露30 d，表达量极显著增高。在10-7、10-8mol/L OP组，暴露30 d，StAR mRNA表达量达到最大值。表明StAR是对OP反应较为灵敏的作用元件，OP剂量和暴露时间的差异对StAR mRNA表达的影响较为明显。
3. 用RT-PCR成功扩增了322bp 的CYP19 cDNA序列（序列号HQ 602881），用该片段序列合成RNA探针进行原位杂交，检测CYP19 mRNA在精巢中的表达，结果显示CYP19 mRNA阳性反应主要存在于间质细胞，生精细胞和支持细胞中较少。免疫组织化学方法检测P450arom的表达主要在间质细胞。
实时定量PCR检测CYP19 mRNA的表达水平，在10-8mol/L OP组，暴露20 d，CYP19 mRNA表达量显著增高，暴露40 d达到最大值。在10-6、10-7mol/L OP组，暴露10 d、20 d，CYP19 mRNA的表达量增高不显著，暴露30 d，CYP19 mRNA的表达量显著增高，暴露处理40 d，与30 d相比，10-6mol/L OP组表达量增高不显著，但10-7mol/L OP组表达量显著增高。表明OP暴露可诱导CYP19 mRNA表达，在一定OP浓度下暴露，随着暴露时间的延长，CYP19 mRNA的表达高调，从而产生雌激素效应。
4. 本实验以E2作为阳性对照，10-9、10-8mol/L E2组，StAR与CYP19 mRNA的表达量显著高于10-6mol/L OP组。表明雌激素17β-E2对于StAR与CYP19的影响远大于OP。