● 摘要
胃癌是一种在中国、日本等东亚国家高发的消化道恶性肿瘤，目前在其治疗方面存在着早期诊断低导致患者错失最佳手术时机以及药物毒副作用较大等诸多困境。探究胃癌发生与发展的机制以达到对胃癌的基因靶向治疗可能是解决目前胃癌临床这些困境的希望所在。因此，胃癌发生、发展相关基因的研究具有重要的研究价值。胃癌的发生、发展是一个长期的、慢性的、各种基因变化积累的十分复杂的由量变到质变的过程，其中涉及多基因的突变或者异常表达和调控，最终引起细胞显性的恶性生物学行为。
文献以及本实验室以往研究均提示ANXA2在包括胃癌在内的多种恶性肿瘤组织高表达，可能与肿瘤的发生、发展密切相关。为了揭示ANXA2表达与胃癌恶性病程发展的关系，评估其在胃癌发展过程中的重要性以及作为胃癌靶向诊治的靶分子的潜在价值，本研究以目前常用于基因功能研究的RNAi技术对ANXA2与胃癌SGC-7901细胞的增殖、迁移的关系以及其与可能相关基因的表达调控关系进行了研究。
方法
1. 从Gene Bank数据库中检索ANXA2基因的生物信息，依据siRNA设计原则以在线软件设计ANXA2的靶向干扰序列，经Blast Hit检索其特异性并克隆至表达载体pU6H1-GFP，构成重组质粒。
2. 采用磷酸钙转染法，将ANXA2干扰质粒转入人胃癌SGC-7901细胞，同时设野生组作为阴性对照；转染后72h检测细胞内GFP表达量，以此评估转染效率；并以半定量RT-PCR和Western blot方法判定ANXA2被抑制率。
3. 采用流式细胞仪技术检测ANXA2敲低后对SGC-7901细胞周期的影响。
4. 以Hoechst 33342、 MitoViewTM 633染色法及倒置荧光显微镜、激光共聚焦扫描显微镜等观察ANXA2敲低后SGC-7901细胞核形态变化以及线粒体膜电位变化。
5. 采用TransWell技术检测ANXA2表达对SGC-7901细胞运动力的影响。
6. 以基因共定位表达方法检测ANXA2与FAK之间的相互作用关系。
7. 以RT-PCR、Western blot法，检测转染72h后的各组细胞ANXA2 相关基因（tPA、S100A10、β-actin）的mRNA与蛋白表达水平，分析它们与ANXA2基因表达的相关性。
结果
1. 靶向ANXA2的siRNA重组质粒构建成功，转染重组质粒至SGC-7901细胞的磷酸钙法转染效率理想，达80%以上。
2. 实验证明转染ANXA2的靶向性siRNA重组质粒能有效而特异的抑制SGC-7901细胞ANXA2基因的表达。
3. 综合细胞核和线粒体的特异性染色、流式细胞仪检测及TansWell实验等结果提示，当ANXA2基因表达下调后，SGC-7901细胞周期被阻滞于G1期，但未发现明显的凋亡特征；细胞迁移能力（运动性）明显降低。
4. 基因共定位表达实验结果提示ANXA2与FAK共定位表达，说明它们之间可能存在某种相互关系。
5. RT-PCR、Western blot 结果显示：抑制ANXA2表达能够显著抑制S100A10、tPA 的表达，而对β-actin表达没有发生明显影响。
结论
ANXA2 表达与胃癌细胞的运动力密切相关，抑制ANXA2 表达可有效降低胃癌细胞的运动力；抑制ANXA2 表达可以明显抑制胃癌细胞的体外增殖，阻滞细胞周期的进程，然而对胃癌细胞的凋亡没有明显影响。实验结果也提示ANXA2 的表达与S100A10、tPA 的表达呈明显正相关，但与β-actin 的表达无明显相关性。
总之，本研究结果从一个角度揭示ANXA2 的高表达参与了胃癌的发展这一极其复杂的病理过程，提示该基因可能在胃癌的靶向诊断与治疗方面具有重要价值，值得进一步研究。