题目：绿豆、小麦钙调蛋白基因的克隆及分析

钙调蛋白（Calmodulin）是生物体中广泛存在的一类结构保守的调节蛋白。钙调蛋白通过和Ca2+结合，并与靶酶相互作用，调控细胞的发育和对外界刺激的反应。它参与多种生理过程，如基因表达、调节细胞分裂和代谢、生殖发育和细胞膜通道调控等功能。现已从多种植物，如拟南芥、大麦、水稻、辣椒、甜菜、丹参和豇豆中成功克隆了钙调蛋白基因。
绿豆是一年生豆科草本植物，它既是一种粮食作物，也是药用植物。以种子和种皮(绿豆衣)入药，具清热祛暑、解毒之功效。小麦是世界上重要的粮食作物之一，在谷类作物中其产量占到17%，是世界35%人口的主要食品作物。因此，本研究选择这两种重要的粮食作物作为实验材料具有一定实际价值。
绿豆（Phaseolus radiatus L．）钙调蛋白基因未见报道，从小麦中已克隆出钙调蛋白基因。本研究首次从绿豆（Phaseolus radiatus L．）中克隆了钙调蛋白基因, 并且克隆了小麦（Triticum aestivum L.）钙调蛋白基因，对基因结构进行了分析。分别从小麦、绿豆叶片中提取总RNA，逆转录为cDNA。通过PCR，扩增得到钙调蛋白基因。绿豆和小麦钙调蛋白cDNA全长均为447bp，包含了完整的读码框，编码148个氨基酸。通过把小麦和绿豆钙调蛋白基因序列、推导的蛋白质序列进行相似性分析，发现小麦钙调蛋白基因和绿豆钙调蛋白基因核苷酸的相似性为84.6%，氨基酸的相似性为95.6%。本文得到的小麦钙调蛋白基因与已知的小麦钙调蛋白基因相比，相似性高达85%以上。与已知的其它多种植物钙调蛋白基因相比也有很高的相似性，核苷酸序列相似性在80%以上，编码的氨基酸序列相似性在90%以上。在Genebank进行了注册，绿豆钙调蛋白基因注册号为DQ778070，小麦钙调蛋白基因注册号为EF577270。
将绿豆、小麦钙调蛋白基因分别正向、反向插入pCambia1304表达载体，经PCR和酶切验证，绿豆、小麦钙调蛋白基因确已插入植物表达载体；再将植物反义表达载体分别通过农杆菌介导法转入丹参植物体内，分析钙调蛋白对植物的生长发育的作用。这为进一步研究钙调蛋白的功能奠定了基础。
用TMHMM、ProtScale、SOPMA、Pfam等在线生物信息学软件分析了绿豆钙调蛋白和小麦钙调蛋白的亲/疏水性、跨膜结构域、卷曲螺旋结构及功能域，并对它进行了亚细胞定位和二级结构预测。结果表明绿豆钙调蛋白和小麦钙调蛋白亲水性大于疏水性，是亲水性蛋白质；并且它们不具有信号肽，位于细胞质中，在细胞质中合成并以可溶性状态保留在细胞质中；二级结构主要为α-螺旋，含有四个功能域（efhand），可以和钙离子结合激活下游反应，起到信号传导的功能。
热激蛋白(heat shock protein, Hsp)是一类受到高温或其它一系列逆境诱导的蛋白质。细胞中主要的热激蛋白包括Hsp60, Hsp70, Hsp90和低分子量Hsp的家族。热激蛋白能消除热胁迫的影响,有效地保护细胞和生物体。在高温条件下,许多生物体(包括植物) 中,都能够产生热激蛋白。本研究同时从油菜（Brassica campestris L.）中克隆了热激蛋白基因片断，对基因序列进行了分析。通过PCR扩增得到了834 bp的片断，编码278个氨基酸。通过在NCBI上进行比对，发现它和拟南芥热激蛋白基因有很高的同源性：核苷酸的同源性在88.1%，氨基酸的同源性在90%以上。利用DNAstar和DNAman等在线生物软件分析了油菜热激蛋白的核苷酸序列、推导的蛋白质序列、开放读码框的亲水性/疏水性，卷曲螺旋结构，并对蛋白质二级结构进行了预测。