● 摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）药用草本植物，在我国境内广为种植。以其干燥根及根茎入药，味苦，性微寒，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦等功效，被广泛用于心脑血管疾病的治疗，并能预防癌症以及各种炎症。研究表明，脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物是丹参的两大主要活性成分。其中水溶性的酚酸类物质主要包括迷迭香酸、丹酚酸B以及丹参素等，其合成与苯丙烷代谢途径相关。基于传统中药多以水煎服的用药方式，丹参的水溶性酚酸类成分被普遍认为是丹参发挥药效的主要活性物质，受到研究者的普遍关注。随着对丹参各种药理活性研究的逐渐深入，市场对其需求量也逐年增加，导致丹参野生资源被严重破坏。因此，利用各种生物技术手段改良丹参品质，提高丹参药用活性成分含量具有重要的意义。植物代谢网络错综复杂，受多种酶调控，同时也受各种内外因素的影响，通过对代谢途径上的单个酶基因进行遗传修饰以达到提高某一目的代谢物的产量往往难以产生显著效果。研究发现WD40/MYB/bHLH转录因子蛋白复合体可调控（或显著调控）多个参与次生代谢途径的关键基因的表达，从而影响最终代谢物的产量。因此，通过调控转录因子的表达以提高药用植物活性成分产量成为了一种重要可行的方式。本研究从丹参转录组数据库中筛选出一条花青素合成途径中的调控基因（SmTTG1），克隆得到基因全长，并通过基因转化技术得到丹参SmTTG1过表达及干涉株系，对该基因的功能进行研究，初步探讨了SmTTG1做为三元复合体（MYB-bHLH-TTG1）中的一员以及其单独行使功能的作用。为进一步利用基因工程改良丹参品种、调控丹参次生代谢物质和提高丹参有效成分的含量奠定基础，同时为丹参功能基因组学的研究提供一定的数据。
主要的研究内容及结果如下：
1. 从丹参转录组数据库中筛选出一条长为981 bp的基因片段，通过BD Walking、基因拼接得到一个具有1002 bp完整开放读码框（ORF）的基因，编码333个氨基酸残基。经Blastn分析发现所得的基因片段与其它物种中的Transparent testa glabra 1（TTG1）基因有很高的相似度，并且其编码蛋白具有WD40蛋白结构域，命名为SmTTG1。
2. 利用PCR技术分别从丹参cDNA及gDNA水平克隆得到了SmTTG1基因序列，该基因含有长为1002 bp的完整开放读码框，无内含子。运用Protscale、TMHMM、TargetP、NetPhos和SOPMA等生物信息学软件对该基因编码氨基酸序列进行分析，结果表明：SmTTG1的理论分子量为36.9 kDa，等电点为4.751，是一个不具有跨膜结构域和信号肽的酸性疏水胞质蛋白。
3. 利用BD Walking技术克隆SmTTG1 5’端启动子区，得到约2000bp的序列。顺式作用元件分析结果显示，该启动子区分布有MYB结合位点和多种激素响应元件。通过实时荧光定量PCR技术对所克隆的SmTTG1基因进行定量分析，结果显示：SmTTG1基因在丹参的根、茎、叶和花中均有表达，在叶中的表达量最高。在丹参花的不同发育时期，SmTTG1基因的表达量随时间呈递增趋势。MeJA（500 µM）、GA3（50 mM）、SA（5 mM）、ABA（100 µM）、创伤和低温处理均能够诱导SmTTG1基因的表达。
4. 通过基因转化技术得到丹参SmTTG1过表达及干涉株系。观察过表达、干涉及对照植株表型变化，并进行了生物学统计分析。结果显示：在丹参过表达株系生长初期，其叶片及茎节处有显著的花青素积累现象（颜色变红），变红率达96.77%。随着转化丹参幼苗的生长，过表达株系叶片中的花青素积累现象逐渐消失，而茎节处仍为红色。同时，过表达株系表现出了部分致死现象，致死率为33.87%。然而，在干涉株系中，没有花青素积累现象，也没有因生根缓慢和生长状态不佳而引起的致死现象。对2月龄的转基因丹参进行显微观察发现：过表达株系的表皮毛状体较对照显著增加，而干涉株系几乎无表皮毛状体产生。
5. 分析60 d苗龄组培苗过表达、干涉及对照株系中总酚酸、总黄酮及花青素含量，结果显示：过表达株系OT-10的总酚酸和总黄酮含量分别是对照（CK）的1.92和1.97倍（P < 0.05），株系OT-14的总酚酸和总黄酮含量分别是对照（CK）的1.6和1.55倍（P < 0.05），花青素含量较对照均无显著变化（P > 0.05）。干涉株系iT-2的总酚酸、总黄酮及花青素含量分别是对照（CK）的59 %、54 %和29 %（P < 0.05），株系iT-3的总酚酸、总黄酮及花青素含量分别是对照（CK）的68 %、48 %和25 %（P < 0.05）。
6. 采用HPLC技术检测丹参60 d苗龄试管苗及两月龄实生苗转基因株系及对照株系的酚酸成分，结果显示：丹酚酸B和迷迭香酸的含量在丹参两种苗龄的干涉株系中较对照均显著降低（P < 0.05）；而在过表达株系中的含量较对照均无明显变化（P > 0.05）。
7. 为了进一步探究SmTTG1基因的表达变化对丹参酚酸类成分合成途径的影响，我们采用实时荧光定量PCR技术，对转基因株系及对照株系丹参酚酸类活性成分次生代谢途径中的12个关键酶基因进行表达丰度分析。结果显示：苯丙烷中心代谢途径中的PAL、C4H、4CL、RAS基因在过表达株系OT-10和OT-14中较对照均显著上调，在干涉株系iT-2和iT-3中均显著降低；酪氨酸代谢途径中的TAT和HPPR基因在过表达株系OT-10和OT-14中较对照均显著上调，在干涉株系iT-2和iT-3中较对照无明显变化；类黄酮代谢途径中的CHS和DFR基因在过表达株系OT-10和OT-14中的表达量较对照均显著上调，其中DFR基因在干涉株系iT-2和iT-3中的表达量较对照显著降低。
本研究通过在丹参中过表达及干涉SmTTG1基因，分别得到了丹参SmTTG1过表达及干涉转基因株系，初步探讨了SmTTG1转录因子在丹参花青素的积累和毛状体的形成中具有重要作用，同时也证明了SmTTG1在丹参酚酸类化合物的形成过程中具有一定的作用。