● 摘要
两栖动物变态是一个受甲状腺激素（thyroid hormones, THs）调节的复杂的过程，在这一过程中大部分器官都要经历组织的重构。而THs是通过与甲状腺激素受体（thyroid hormone receptors, TRs）的结合来发挥作用。本文通过研究TRs在中国林蛙（Rana chensinensis）变态过程中的表达变化探索THs在两栖动物变态过程中的作用。本实验首先根据牛蛙（Rana catesbeiana）TRα和TRβ基因序列分别设计特异性引物，用PCR扩增技术克隆得到中国林蛙的TRα和TRβ基因片段。利用DNAStar，SMART和ProParam等生物学软件进行序列拼接，预测TRα和TRβ蛋白分子量，二级结构和三级结构等。然后通过GenBank数据库中牛蛙和粗皮蛙（Rana rugosa）的氨基酸序列与中国林蛙进行结构域的比较分析。其次选取牛蛙, 黑斑侧褶蛙（Pelophylax nigromaculatus），豹纹守宫（Eublepharis macularius），原鸡（Gallus gallus）等10种脊椎动物进行ClustalW比对，MEGA5.1构建进化树进行进化分析。最后使用半定量PCR和荧光实时定量PCR检测TRα和TRβ在33到46期中国林蛙蝌蚪肝脏，脑，皮肤和尾部四种组织中的表达状况。分析结果如下：
1.用成体中国林蛙肝脏组织扩增得到TRα和TRβ的cDNA全长分别为1257bp和1122bp，均包含一个完整的开放阅读框，分别编码418和373个氨基酸。将获得的TRα和TRβ序列上传至GenBank数据库（No，KJ579109.1，KJ579110.1），将其命名为rcTRα和rcTRβ。软件分析结果表明rcTRα和rcTRβ序列中均不存在N-末端信号肽，意味着两者均为非分泌蛋白。（1）rcTRα的起始密码子和终止密码子分别为ATG和TAA，分子量为47.79 kDa，等电点为7.08，蛋白质二级结构包含46.89%的自由卷曲，48.09%的α-螺旋，4.31%的延伸链。序列内主要包含3个结构域：ZnF_C4 domain (58-131), coiled coil domain (137-165)和HOLI domain (228-386)，还包含VMC domain (10-64), IBR domain (44-99), HOX domain (149-199)等结构域。（2）rcTRβ的起始密码子和终止密码子分别为ATG和TAG，分子量为42.28 kDa，等电点为6.76，蛋白质二级结构包含40.48%的自由卷曲，50.94%的α-螺旋，6.17%的延伸链。序列内包含2个主要的结构域: ZnF_C4 domain (16-89)和HOLI domain (186-344)，还包含MCM domain (1-372), RING domain (19-76), HOX domain (107-157)等结构域。
2．预测的氨基酸序列结构域比较分析表明，rcTRα和rcTRβ均包含A/B，DBD，D和LBD等结构域，并且DBD包含两个富含半胱氨酸的锌指结构，这些均属于核激素受体的典型特征，与牛蛙和粗皮蛙的TRs序列有较高的一致性，推断获得的TRs是甲状腺激素核受体的成员。rcTRα与rcTRβ的比对结果显示，二者的氨基酸序列存在一定的差异，rcTRβ在A/B domain有42个氨基酸缺失，且在DBD，D和LBD存在51个氨基酸的差异。
3.进化树分析显示，中国林蛙的TRα和TRβ是明显分离的、位于两个进化枝中。在TRα和TRβ两个进化枝中，中国林蛙均与牛蛙，粗皮蛙和黑斑侧褶蛙组成一群。这些结果与它们同属于蛙属的事实一致。而且，rcTRα和rcTRβ分别在两个进化枝中有相似的位置。rcTRα和rcTRβ的氨基酸和核苷酸序列同源性分析表明，rcTRα和rcTRβ与其他无尾两栖类物种的同源性较高，与爬行类，鸟类以及哺乳类物种的同源性相对较低。与rcTRα相比，rcTRβ与其他所分析物种的同源性较高。rcTRα和rcTRβ的核苷酸同源性为72%，氨基酸同源性为87%。这一结果与所分析的其他物种相似。
4.荧光实时定量PCR和半定量PCR结果基本一致，显示在中国林蛙蝌蚪变态过程中，肝脏，脑，皮肤和尾部组织中rcTRα和rcTRβ均有表达，但表达模式存在差异，rcTRα的表达变化较温和，而rcTRβ的表达变化则较剧烈。另外，rcTRβ mRNA水平在预变态时期相对较低，之后在变态高峰期达到峰值。在所检测的四种组织中，脑中rcTRα 的表达变化最缓和，在蝌蚪的整个变态过程中几乎维持一个较高的水平。rcTRα和rcTRβ在不同的组织特异性表达表明，在林蛙的变态过程中，THs在不同器官和组织中发挥的作用不同。