● 摘要
迄今为止，研究发现有20多种人类疾病与蛋白质的淀粉样纤维化有关，如阿尔兹海默症，帕金森病，二型糖尿病等，这些疾病产生的原因是相关蛋白的淀粉样变性，之后沉积于细胞间质，引发细胞膜的透性改变，引起组织功能损伤，最终引发疾病。研究发现，不仅那些与疾病相关的蛋白，其他与疾病不相关的蛋白或多肽也会发生淀粉样变性。如溶菌酶，胰岛素等，这些蛋白的淀粉样聚集体也会表现出生物毒性。
淀粉样纤维的生成过程很复杂，至今不是很清楚。简单而言即蛋白在外界条件如，PH，盐离子浓度，离子强度，温度等的变化下发生解折叠或错误折叠，由可溶性的蛋白变为不溶性的聚集体。尽管淀粉样蛋白的前体不尽相同，但是大多数淀粉样纤维的形成过程遵循统一过程。那就是成核阶段和延伸阶段。变性的蛋白在一定条件下先形成纤维核，这一阶段称为成核阶段，之后陆陆续续的单体再与纤维核结合形成原纤维，这个阶段称为“延滞期”。原纤维再进一步聚集形成成熟的纤维。成熟的纤维可以被打断形成纤维核，缩短淀粉样纤维的形成时间。
从分子水平上更好的理解淀粉样物质形成的过程的机理，探寻影响这一过程的物质，对于临床药物的筛选及对这种病的治疗都有重要的意义。
本文的撰写可分为两大部分：
首先选用牛胰岛素作为模型蛋白，研究在异种蛋白及聚乙二醇存在的条件下，牛胰岛素淀粉样纤维化过程中的构象变化。由于异种蛋白自身纤维化的干扰，未能进一步检测，最后换作选用聚乙二醇（PEG）作为抑制物，探究其对胰岛素纤维化的作用。
其次本文又选取溶菌酶为蛋白模型，探索PEG在溶菌酶淀粉样纤维化中的作用。首先建立了一种非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，对保持活性的溶菌酶或其聚集体进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，探究PEG对溶菌酶纤维化的影响，采用荧光探针技术和圆二色谱等技术检测溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的生长和构象变化。
实验方法和研究成果：
第一部分
研究在异种蛋白和PEG存在条件下，胰岛素淀粉样纤维化及由此引起的细胞毒性作用。结果证实，异种蛋白和PEG均能够延迟胰岛素的淀粉样纤维化，使纤维的ThT和ANS荧光强度减小，但是不可以改变胰岛素纤维的表观结构。
第二部分
1. PEG对溶菌酶纤维化的抑制作用
采用ThT荧光检测淀粉样纤维的生长。结果表明，PEG对溶菌酶淀粉样纤维的形成具有抑制作用，抑制作用与PEG浓度呈正相关。
采用圆二色谱检测溶菌酶纤维化过程的二级结构的变化情况，结果表明，纤维在孵育过程中可以观察到二级结构中α-螺旋下降和β-折叠增加的总体趋势，与淀粉样纤维化的动力学特征相吻合。
2. Native-PAGE检测PEG对溶菌酶纤维化的抑制作用
采用Native-PAGE检测，PEG对纤维的成核期有抑制作用，对已经形成的纤维没有作用。溶菌酶纤维在孵育过程中会发生酸水解，PEG可抑制蛋白的酸水解产物的生成。
3. 纤维形态的检测
主要采用透射电子显微镜检测纤维形态。成熟的纤维在透射电镜下，可观察到典型的丝状纤维结构。在PEG的存在下，纤维的形成受到了抑制。当PEG浓度较高时，溶菌酶不能形成典型的纤维结构，与ThT荧光检测的结果相符。
4. 紫外光谱扫描
在同等条件下，比较含有PEG的溶菌酶纤维和不含PEG的溶菌酶纤维对刚果红溶液的紫外吸收的影响。结果表明，两种纤维的加入均可以使得刚果红的最大紫外吸收发生红移，而含有PEG的溶菌酶纤维使得刚果红最大紫外吸收幅度较小，说明PEG对纤维的形成有抑制作用。
结论：1 本文研究了两种异源蛋白及PEG对胰岛素淀粉样变性的影响，发现两种异源蛋白对胰岛素纤维化和细胞毒性具有抑制作用。
2 溶菌酶在本文的实验条件下可以形成淀粉样纤维，在纤维化过程中，伴随着溶菌酶分子的α螺旋减少，β-折叠增加，以及疏水区域外露。PEG对溶菌酶淀粉样纤维的形成具有抑制作用，抑制作用与浓度呈正相关。较高浓度下，溶菌酶不能形成典型的纤维结构，细胞毒性作用也随之降低。PEG通过抑制溶菌酶的酸水解，以及降低溶菌酶分子的有效碰撞几率，抑制了溶菌酶分子的自组装方式和纤维化进程。