● 摘要
力学负荷对骨骼的发育、生长和代谢至关重要。空间失重环境引起机械负荷消失，从而导致骨组织细胞信号转导、基因表达、细胞增殖和分化等功能发生改变，这可能是微重力导致骨丢失的重要原因之一。骨细胞是骨组织中数量最多的细胞，它不仅可以将机械应力信号转化为生化信号，并且可将信号传递到骨组织其他类型细胞，调控其功能活动。Wnt/β-catenin信号通路是骨细胞内重要的力学信号转导通路。本论文主要研究在模拟微重力效应对骨细胞Wnt/β-catenin信号通路应答流体剪切力的影响，以期为阐明失重引起骨丢失的机制提供理论和实验依据。
以小鼠骨细胞（MLO-Y4）为研究对象，随机分为对照组、旋转（R）组，旋转培养6h，用RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路中主要组分Wnt3a、Wnt5a、LRP5/6、β-catenin、Lef1、Cyclin D1、CX43、SOST和DKK1的mRNA表达水平变化。实验结果显示，模拟微重力效应下，靶基因Lef1和Cyclin D1的mRNA表达水平显著降低，CX43的显著升高，抑制剂SOST和DKK1的显著升高，而Wnt3a、Wnt5a、LRP5/6和β-catenin的无明显变化。另外，加入抑制剂Sclerostin（由SOST基因编码）的抗体后，再用 RT-PCR法对SOST，β-catenin，Lef1，Cyclin D1，CX43的mRNA的表达情况进行分析，实验结果显示，与C组相比，C+Ab组的SOST、β-catenin和 LEF-1的 mRNA表达水平明显升高；与R组相比，R+Ab组的SOST、Cyclin D1和LEF-1的mRNA表达水平明显升高；与C+Ab组相比，R+Ab组的SOST、β-catenin和 LEF-1的 mRNA表达水平明显升高，而Cyclin D1、LEF-1和CX43的水平降低。提示，模拟微重力效应可导致骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的活性下降。
进而，利用旋转在线剪切装置（流体剪切力15dyn/cm2）培养MLO-Y4细胞6h，用RT-PCR法检测Wnt/β-catenin信号通路中主要组分Wnt3a、Wnt5a、LRP5/6、β-catenin、Lef1、Cyclin D1、CX43、SOST和DKK1的mRNA表达水平变化，用免疫荧光染色法检测关键分子β-catenin亚细胞分布的变化。细胞分为对照（C）组、旋转（R）组、剪切（CS）组、旋转剪切(ORS)组，实验结果显示，CS组与C组相比，Wnt5a和β-catenin的mRNA表达升高，而CX43的mRNA表达升高下降；ORS组与R组相比，Wnt3a的mRNA表达上升，而Wnt5a和CX43的mRNA表达降低；ORS组与CS组相比，Wnt5a、Lrp5和CX43的mRNA表达上升，而Cyclin D1和LEF-1的mRNA表达降低。β-catenin染色结果显示，R组与C组对比，β-catenin核转移减少，CS组与C组相比，β-catenin核转移增加，ORS组β-catenin蛋白分布与C组相似。
上述研究结果提示，流体剪切力可以激活骨细胞Wnt/β-catenin信号通路，模拟微重力效应可导致骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的活性下降，且模拟微重力效应可以抑制Wnt/β-catenin信号通路对流体剪切力的应答，但其具体的发生机制还有待进一步深入研究。