题目：三叶木通AktAG1和AktSEP3 基因的克隆和表达分析

三叶木通（Akebia trifoliata (Thunb.) Koidz.）为木通科(Lardizabalaceae)木通属(Akebia Decne.)的落叶木质藤本植物，在我国，主要分布在河北、山西、山东、河南、陕西南部、甘肃东部及长江流域各省区。2010版药典将三叶木通藤茎和果实分别收录入木通和预知子药源。三叶木通的花为雌雄同序的单性花，花序具多样性，可分为完全花序类，单雄花序类和单雌花序类。雌花和雄花都是以两性花的方式开始发育的，单性花是由于在花发育的最后阶段，雌花中雄蕊或者雄花中的心皮退化而产生的。

目前的研究表明花的发育受基因、染色体、环境等多种因素影响，依植物类型不同而不同。在广为接受的基因影响花发育的“ABCDE”模型中的所有基因，除AP2以外都属于MADS-box基因家族，AG基因属于C类MADS-box基因，在花发育过程中参与调控雌雄蕊的发育，大量研究表明，AG基因在模式植物、主要农作物及重要经济花卉花发育过程中的功能相对保守。SEP3基因属于E类MADS-box基因，是四轮花器官形态建成的必须因素。本文通过了解三叶木通花发育的分子机制及在雌雄蕊发育过程中C类和E基因的表达情况，探讨三叶木通由两性花发育成单性花的过程中C类和E类基因的调控作用。本研究以不同发育阶段的三叶木通雌雄花器官为实验材料，应用同源克隆及RACE等多种技术手段，分离得到2个和花发育有关的MADS-box基因，分别为AktAG1和AktSEP3基因，并分析了他们的序列结构、系统发育关系和表达式样。主要结论如下：

(1)三叶木通两性花到单性花发育过程的形态观察。三叶木通的花为雌雄同序的单性花，我们将其两性花到单性花的发育过程按照心皮与雄蕊的高度比例分为四个时期。时期1：花序没有明显的雌雄之分，为两性花；时期2：基部雄花中心皮与雄蕊的高度比大于1/2且小于1，雌花中心皮与雄蕊的高度比大于1且小于2；时期3：雄花中的雄蕊明显高于心皮，心皮与雄蕊的高度比小于1/2；雌花中的心皮明显高于雄蕊，心皮与雄蕊的高度比大于2；时期4：雄花中的心皮已经退化为很小或消失，雌花中的雄蕊退化消失。

(2)三叶木通花芽总RNA提取方法的比较。本研究选取了四种常规的植物RNA提取方法，包括CTAB-LiCl、SDS-酸酚法、Tris-硼酸法及RNA提取试剂盒，结果表明用CTAB-LiCl法和植物RNA提取试剂盒所提取得三叶木通花芽总RNA，完整性好，产率高。

(3)三叶木通AktAG1和AktSEP3基因的克隆。应用同源克隆和RACE技术，分离得到三叶木通C类和E类基因各一个，分别为AktAG1和AktSEP3基因。氨基酸序列分析结果表明这2个基因都属于MIKC型MADS-box基因。AktAG1基因cDNA全长为1009bp，最大开放阅读框为738bp，编码氨基酸245个，属于AG-like基因亚家族。AktSEP3基因cDNA全长为1002bp，最大开放阅读框为729bp，编码氨基酸242个，属于AGL9基因家族。序列同源性分析表明两类基因和基部被子植物亲缘关系最近，这说明物种亲缘关系越近，序列同源性越高。

(4)三叶木通AktAG1和AktSEP3基因的表达分析。半定量RT-PCR实验结果表明，AktAG1和AktSEP3基因在三叶木通的花器官中均有表达，AktAG1基因在花萼片中表达水平低，在心皮及雄蕊中高表达，在叶片中不表达，并随着花发育时期的变化，雌花中表达量先增加后降低，雄花中表达量不变；AktSEP3基因在不同花器官及各器官的不同发育时期表达量基本保持不变。