● 摘要
中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科毒蛇，是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种蝮蛇，广泛分布于我国西北和华北地区。蛇毒磷脂酶A2（Snake venom phospholipase A2, svPLA2）是蛇毒液中毒性最强的组分之一，除酶活性外，还表现出多种毒理药理学活性，具有潜在的利用价值。但是，关于中介蝮蛇磷脂酶A2神经毒素的毒理学活性、结构与功能的关系、作用机理等有待阐明，而分离获得PLA2神经毒素是解决这些问题的前提。
本论文的研究内容及结果：
1．中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化
（1）凝胶过滤层析
利用凝胶过滤填料Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行初步分离，缓冲液为50mmol/L碳酸氢铵（pH 8.0），分离得到5个蛋白峰（P1-P5）。分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验，SDS-PAGE分析各个峰组分的蛋白纯度。结果表明，P2与P3为磷脂酶A2神经毒素，而P1、P4、P5中均不是磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析表明这两个目的蛋白峰不是单一条带，因此需要进一步分离。
（2）阴离子交换层析
利用HiTrap DEAE阴离子交换层析柱对P2和P3做进一步的分离纯化，先用A液（50mmol/L醋酸铵，pH 7.3）洗脱未结合的组分，之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵，0.5mol/L NaCl，pH 7.3）进行线性梯度洗脱。收集各个穿透峰及洗脱峰，分别测定各个峰组分磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验，SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明， P2-5、P3-2和P3-3为PLA2神经毒素，SDS-PAGE分析表明P2-5、P3-2和P3-3不是单一条带，仍需进一步的分离纯化。
（3）阳离子交换层析
利用HiTrap CM阳离子交换层析柱对P2-5、P3-2和P3-3进行分离纯化，A液（50mmol/L醋酸铵，pH 5.3）洗脱未结合的组分，之后0%-100%B液（50mmol/L醋酸铵，0.5mol/L NaCl，pH 5.3）进行线性梯度洗脱，收集各穿透峰及洗脱峰。分别测定各个峰组分的磷脂酶A2活性及小鼠急性毒性实验，用SDS-PAGE分析各个组分的蛋白纯度。结果表明，P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1具有酶活性，是导致实验动物偏瘫、呼吸衰竭的致死组分，为磷脂酶A2神经毒素。SDS-PAGE分析显示，P2-5-1、P3-2-1、P3-3-1纯度很高，接近单一条带，分子量在14kDa左右。
2．生物学活性初步检测：
（1）酶活性：采用人工合成底物4-硝基-3-苯甲酸（NOB）测得P3-2-1的酶活力为352nmol/min.mg，Vmax为7.21nmol/min，最适温度为35°C，最适pH为8.0，且依赖于Ca2+。
（2）间接溶血活性：采用红细胞血红蛋白释放法测定P3-2-1组分的间接溶血活性，1% Triton X-100为阳性对照、等体积的Tris-HCl为阴性对照，结果表明P3-2-1组分具有一定的溶血活性，溶血率为21%。
（3）肌肉毒性：采用CK肌酸激酶试剂盒测定中毒小鼠血清肌酸激酶（CK）的酶活力。小鼠肌肉注射P3-2-1组分后，2h、4h、6h、8h与0h组相比，CK酶活力均显著升高，注射2h后酶活力达到最大值。
（4）抑菌活性：粗毒为阳性对照，无菌去离子水为阴性对照，检测P3-2-1组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效应，结果显示P3-2-1可显著地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，说明P3-2-1具有抑菌活性。
结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术，成功地从中介蝮蛇粗毒中分离纯化得到磷脂酶A2神经毒素，分子量为14kDa，最适温度为35°C，最适pH为8.0，依赖于Ca2+，具有间接溶血活性、肌肉毒性及抑菌活性。本工作为进一步研究中介蝮磷脂酶A2神经毒素的分子进化及作用机理奠定了理论基础。