● 摘要
蛇毒类凝血酶（SVTLEs）广泛存在于蝰科蝮亚科蛇的蛇毒中，属于蛇毒丝氨酸蛋白酶家族。它在体外能够直接作用于纤维蛋白原，导致纤维蛋白单体首尾聚合从而形成凝块，功能与人凝血酶十分相似被称为类凝血酶（TLE）。但在体内时，由于它不激活凝血因子XIII，水解生成的纤维蛋白凝块没有发生侧链的交联，很容易被体内单核吞噬细胞系统或正常的纤溶作用所清除，最终表现为抗凝和降纤的效果。自从1936年首次从巴西矛头蝮蛇毒中分离类凝血酶以来，因其良好的应用前景使关于SVTLEs的研究不断发展，临床上已经开始将SVTLEs运用于抗血栓、止血、试剂诊断等方面。中介蝮（Gloydius intermedius）属于蝰科蝮亚科亚洲蝮属，广泛分布与我国西北及部分华北地区，其毒性为我国常见6种蝮蛇之最，而有关其类凝血酶的研究却未见报道。因此，本课题选择中介蝮蛇毒中蛇毒类凝血酶基因GI-TLE1通过毕赤酵母进行表达并对其相关生物活性进行了检测。
实验内容：
1. 本研究以来自中介蝮毒腺cDNA文库中的类凝血酶-1（GI-TLE1）基因为研究对象。首先对基因序列进行密码子优化，其次通过人工全序列合成了优化后的基因序列，最后经SnaB I和Not I酶切后与pPIC9K载体连接，以热激法转化入大肠杆菌TOP10感受态细胞，通过PCR和基因测序来鉴定重组载体pPIC9K/GI-TLE1的构建情况。
2. 利用Sac I内切酶将重组载体pPIC9K/GI-TLE1线性化，用电穿孔法将其引入毕赤酵母GS115基因组中, 电转化参数为1500V，25μF，200Ω，放电时间分别为：4.7ms和4.5ms；通过不同G418浓度的YPD平板进行高抗性转化子筛选，利用MM和MD平板对转化子进行甲醇利用型鉴定；利用试剂盒法提取重组后的GS115-TLE1酵母菌基因组,通过PCR鉴定其插入方式和表型。
3. 经鉴定正确的阳性转化子经摇瓶初步诱导表达后，SDS-PAGE检测在不同时间段（0h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h）的发酵上清中目的蛋白表达情况，利用模拟底物BApNA检测上清蛋白的酰胺水解酶活性。
4. 对目标蛋白rGI-TLE1的发酵条件：不同时间、pH、甲醇添加量、温度以及添加抗氧化剂进行优化，通过测定重组发酵上清蛋白的酰胺水解酶活性来确定最优的发酵参数。
5. 通过NI-NTA亲和柱对优化后的rGI-TLE1蛋白表达上清进行纯化。纯化后的rGI-TLE1蛋白通过Bradford法测定其蛋白浓度，利用丝氨酸蛋白酶特异性抑制物PMSF测定rGI-TLE1蛋白的活性抑制情况，利用牛血清纤维蛋白原测定rGI-TLE1蛋白的类凝血酶活性，采用纤维蛋白平板法测定rGI-TLE1蛋白的纤溶活性。
实验结果：
参考毕赤酵母高频密码子用法对GI-TLE1基因序列进行了同义突变，并在其C-末端引入了6×His标签；通过PCR结果及测序报告证实了已成功构建了重组真核表达载体pPIC9K/GI-TLE1。
利用电穿孔仪将线性化的表达载体pPIC9K/GI-TLE1和pPIC9K成功引入毕赤酵母GS115基因组中，获得了多个转化子。通过不同G418浓度的YPD平板筛选，获得了11个基因组整合型高抗性（4mg/ml）转化子，MM和MD平板筛选结果表明全为Mut+。PCR鉴定结果表明pPIC9K/GI-TLE1和pPIC9K已成功整合入GS115基因组中，且印证了转化子为甲醇快速利用型（Mut+）。
初步诱导表达后的重组蛋白rGI-TLE1经SDS-PAGE检测，出现由浅到深的变化的目的蛋白条带，分子量约为35 kDa，模拟底物BApNA检测表明诱导的蛋白具有酰胺水解酶活性。
通过测定不同发酵条件下的上清蛋白酰胺水解酶活性，结果表明在pH为5.0，甲醇添加量为0.75%，温度为24℃，发酵时间为120h时发酵条件为最佳；添加抗氧化剂进行发酵优化的实验结果表明加入褪黑素可以提高rGI-TLE1蛋白的生物活性，而添加GSH和Vc对rGI-TLE1蛋白表达的影响不大。
按优化后得到的最佳诱导条件进行诱导表达，结果表明优化后的rGI-TLE1上清总蛋白表达量达到了242 μg/ml。与未优化时的初步表达相比，提高了48.7%，酰胺水解酶活性也提高了29.2%。利用Ni-NTA凝胶对rGI-TLE1进行纯化，纯化后的蛋白浓度为59μg/ml。对纯化后rGI-TLE1进行相关生物活性鉴定，丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂鉴定结果表明，rGI-TLE1的酰胺水解酶活性能被PMSF明显抑制，而EDTA对其几乎无抑制作用。类凝血酶活性测定表明rGI-TLE1在与牛血清纤维蛋白原溶液共同作用时不发生凝固现象，而对rGI-TLE1的纤维蛋白平板活性检测结果表明了其具有明显的降解纤维蛋白的能力。
结论：本实验通过一系列方法，成功在毕赤酵母中表达了中介蝮蛇毒类凝血酶GI-TLE1基因，并对rGI-TLE1蛋白进行了表达条件优化、蛋白纯化和相关的生物活性做了鉴定，这些工作为中介蝮其它丝氨酸蛋白酶的毕赤酵母表达及开发利用提供了参考。
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