● 摘要
恶性黑色素瘤（malignant melanoma）是一种恶性程度极高的皮肤肿瘤，多发生于体表，转移早且范围广，约占皮肤恶性肿瘤的7%～20%。近年来的研究显示，我国恶性黑色素瘤的发病率在迅速增长，死亡率也在逐渐增加。目前对于恶性黑色素瘤的治疗除早期手术治疗、化疗及放疗外，还没有发现有效的治疗手段，特别是对于晚期恶性黑色素瘤患者。因此探索恶性黑色素瘤新的治疗手段具有重要的意义。基因治疗作为目前疾病治疗中所采用的一种新手段，在肿瘤治疗中有着重要的应用前景。基因治疗的关键是病毒载体，在目前肿瘤基因治疗中，最引人注目的病毒载体是复制型溶瘤腺病毒载体（replicating oncolytic adenoviral vector）。这类载体同常规的复制缺陷型腺病毒载体Ad5（Adenovirus type 5, Ad5）相比，可以选择性地在肿瘤组织中扩增，大量扩增的病毒最终可将肿瘤杀死，因此具有明显的抗肿瘤活性。有时复制型溶瘤腺病毒载体，也称为条件复制型腺病毒载体(Conditionally Replicating Adenoviral Vector, CRAd)，大致可以分为三种类型：（1）使用肿瘤特异启动子表达E1的复制型溶瘤腺病毒载体；（2）使用55 KD的E1B分子缺失的复制型溶瘤腺病毒载体（命名为HE1B55D）；（3）E1A分子CR2中24个碱基缺失（delta 24, D24）的复制型溶瘤腺病毒载体。以上三种病毒载体在不同肿瘤中的治疗效果存在一定的差异。
HE1B55D可在p53异常的肿瘤细胞内大量扩增，最终将肿瘤细胞杀死。有研究报道HE1B55D与治疗基因的联合应用，较单纯的溶瘤治疗或单纯的基因治疗具有更好的疗效，因此选择合适的治疗基因可以提高HE1B55D对肿瘤的治疗效果。
白介素24（Interleukin 24, IL-24）是利用差减杂交的方法从干扰素β和密执毒素诱导的人黑色素瘤细胞cDNA文库中筛选得到的，该基因具有抑制黑色素瘤增生和促进终末分化的能力。研究发现，IL-24可以选择性诱导肿瘤细胞凋亡，对正常细胞的生长没有影响，且其对肿瘤生长的抑制作用不依赖于p53，Rb及p16等肿瘤抑制基因，因此有关IL-24生物学功能的研究越来越受到人们的关注。IL-24作为一种很有希望的抗肿瘤生物制剂，在I期临床阶段也取得了满意的效果。已有研究表明IL-24可以通过IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2受体依赖的方式进入肿瘤细胞，发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。但目前有关IL-24选择性诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不清楚。本课题将通过酵母双杂交技术筛选出与IL-24相互作用蛋白，旨在为深入研究IL-24的作用机制奠定基础。
有研究表明，arresten能特异性抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导内皮细胞的凋亡；此外，其对新生血管的生成及肿瘤细胞增殖也有明显的抑制作用，但对非内皮细胞没有影响。因此arresten在肿瘤治疗中具有潜在的重要应用价值。
由于多数肿瘤如黑色素瘤、恶性脑胶质瘤及乳腺癌等细胞表面的腺病毒受体CAR（Coxsackie-Adenovirus Receptor, CAR）表达水平较低，导致腺病毒对肿瘤感染效果差；此外肿瘤的发生涉及许多信号通路的参与。因此为了提高HE1B55D对黑色素瘤的治疗效果，本研究课题构建一种新型的条件复制型腺病毒载体HE1B55D-RGD.IL-24/arresten，该载体具有以下特点：（1）可以选择性地在p53突变的肿瘤细胞中特异性扩增，最终将肿瘤细胞杀死；（2）该腺病毒载体的Fiber经RGD修饰后，可以提高其对肿瘤细胞的感染效率；（3）该载体可同时表达对肿瘤血管及肿瘤细胞生长具有抑制作用的IL-24和arresten，从而对肿瘤发挥协同治疗作用，在其溶瘤的基础上进一步增强其肿瘤治疗效果。本课题具体研究内容如下：
（1）IL-24的真核表达与纯化：首先利用分子生物学手段克隆了IL-24基因，酶切测序鉴定基因序列完全正确后，将IL-24基因连至腺病毒穿梭载体pAd5-E1-shuttle-CMV-6His中，然后通过在真核细胞内的同源重组，制备并纯化了重组腺病毒Ad5.IL-24-6His。将腺病毒感染Hela细胞48 h后收获上清，然后利用硫酸铵对上清进行浓缩并通过Ni-NTA亲和柱，对其进行初步纯化。
（2）IL-24的原核表达与纯化：首先应用分子生物学技术，构建含人IL-24编码序列的原核表达载体pRSET-B/IL-24，表达并采用变性方法纯化了人6His-IL-24融合蛋白。其次在pGEX4T-3的C端加入了6His标签，用于下游GST融合蛋白的纯化；然后利用其构建缺失信号肽的IL-24-NS原核表达载体pGEX4T/IL-24-NS/6His，最后表达并应用非变性方法纯化了融合蛋白GST-IL-24-NS-6His。结果显示，成功表达和纯化了足够量的6His-IL-24融合蛋白，为将其作为免疫原制备单克隆抗体奠定了基础；成功表达和纯化了具有生物活性的GST-IL-24-NS-6His蛋白；通过MTT检测表明，GST-IL-24-NS-6His蛋白具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。
（3）IL-24单克隆抗体的制备与鉴定：用上述纯化的人6His-IL-24融合蛋白免疫Balb/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，用间接ELISA方法检测阳性杂交瘤细胞株，然后采用有限稀释法对阳性克隆株进行亚克隆，最后将阳性克隆扩大培养及制备抗体。通过免疫印迹及免疫组化染色对抗体的特异性进行了鉴定。最终结果表明，获得3株能稳定分泌抗人IL-24的杂交瘤细胞，分别命名为1G2，3F4，4A6。通过免疫印迹及免疫组化染色检测显示，这3株单抗均能够与IL-24特异性结合。
（4）新型重组HE1B55D-RGD的构建和体外活性检测：首先采用分子生物学技术，从人cDNA文库中克隆了arresten基因全长，测序鉴定该基因完全正确。将arresten的表达元件插入到E1B-55KD-deletion的腺病毒穿梭载体中，获得pAd5-E1-E1B-55KD-deletion-arresten，然后经与pAd5 backbone/SwaI骨架载体同源重组后，获得pHE1B55D-arresten/SwaI；利用重叠PCR方法获得了RGD修饰腺病毒knob区的穿梭载体pAd5-E4-eGFP-PGK- miniCMV-MCS-Fiber-RGD，将IL-24基因构建到该载体中获得同时表达IL-24和报告基因eGFP的穿梭载体，命名为pAd5-E4-eGFP-PGK-miniCMV-IL-24-Fiber-RGD；将SwaI线性化的pHE1B55D-arresten/SwaI和XhoI线性化的pAd5-E4-eGFP-PGK-miniCMV-IL-24-Fiber-RGD在大肠杆菌BJ5183中同源重组，获得双表达IL-24和arresten的经RGD修饰的新型载体，命名为pHE1B55D-RGD.IL-24/arresten。另外按照上述方法分别构建了单独表达eGFP、IL-24、arresten的HE1B55D-RGD载体。分别用PacI线性化单表达及双表达HE1B55D-RGD载体，转染HEK293细胞后，经扩增、纯化后制备了高滴度的腺病毒，分别命名为HE1B55D-RGD.eGFP，HE1B55D-RGD.IL-24，HE1B55D-RGD.arresten，HE1B55D-RGD.IL-24 /arresten。将上述腺病毒分别感染MEF细胞，48 h后裂解细胞，采用Western blot方法检测目的蛋白的表达，结果显示目的蛋白均能够表达。采用MTT方法检测该腺病毒对肿瘤细胞生长的影响，结果显示，同对照病毒比较，双表达HE1B55D-RGD.IL-24/arresten可以明显抑制肿瘤细胞生长。
（5）新型重组HE1B55D-RGD的体内活性检测：B16F10-G5-luc细胞接种至裸鼠体内建立恶性黑色素瘤的移植瘤模型；待肿瘤体积达到约40 mm3后，按总量2×109 PFU，分四次隔天瘤内注射腺病毒进行治疗，评价体内复制及溶瘤作用。首先通过计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线，表明HE1B55D-RGD.IL-24/arresten治疗组肿瘤生长抑制作用明显，肿瘤抑制率最高达56.5%；治疗20 d后处死裸鼠进行病理学检测，免疫组织化学可以检测到目的蛋白在肿瘤细胞内的表达；CD31染色结果显示实验组的微血管密度明显低于对照组；TUNEL检测结果表明双表达组HE1B55D-RGD.IL-24/arresten的细胞凋亡数目最多，为(21.53±2.37)%。
（6）利用酵母双杂交系统筛选与IL-24相互作用的蛋白：应用分子生物学技术，构建了含IL-24编码区的pGBKT7诱饵载体，然后在酵母中验证其表达并检测其自激活作用；利用酵母双杂交系统从人外周血白细胞cDNA文库中，筛选出能与IL-24相互作用的蛋白HLA-B相关转录本3（BAT3）；利用PCR方法从cDNA文库中克隆出BAT3的全长基因；最后通过酵母双杂交系统、免疫沉淀方法及免疫组化染色等手段验证了IL-24与BAT3蛋白在细胞内的相互作用。结果表明，BAT3与IL-24存在相互作用；将Ad5.IL-24感染Hela细胞后，发现BAT3-Flag由细胞核转位到细胞质中。
综上所述，本课题取得了以下结果：（1）成功纯化了具有生物学活性的GST-IL-24-NS-6His蛋白，验证了该蛋白的功能，并制备了可特异性针对人IL-24的三株单克隆抗体；（2）成功构建了经RGD修饰的双表达IL-24和arresten的新型载体HE1B55D-RGD.IL-24/arresten。体外体内实验表明，该新型溶瘤腺病毒对黑色素瘤细胞的生长具有明显的抑制作用；（3）利用酵母双杂交筛选系统首次得到了可与IL-24相互作用的蛋白BAT3，并通过体外实验验证IL-24和BAT3存在相互作用。
上述研究结果为恶性黑色素瘤及其它肿瘤的治疗提供了一种新型、可行而有效的方法，并为深入研究IL-24选择性诱导肿瘤凋亡的分子机制奠定了重要基础。