题目：隆额网翅蝗线粒体基因组全序列的测定与分析

昆虫线粒体DNA是共价闭合的环状双链DNA分子，大小一般为15.4～16.3kb，以高拷贝数目存在于线粒体内。线粒体DNA的分子质量小，核酸序列和组成比较保守，基因组中不含间隔区和内含子，无重复序列和不等交换，拷贝数多，易于提取、扩增和分析；在遗传过程中不发生基因重组、倒位、易位等突变，严格遵守母系遗传方式，只需少量个体材料就能反映群体的遗传结构；基因组的替换率比核DNA高5~10倍，适合做进化生物学研究。
本文测定和分析了隆额网翅蝗线粒体全序列，并且将其于已经测出全基因组的2种其他直翅目昆虫的mtDNA进行了比较，并联合其他直翅类昆虫的mtDNA进行了线粒体全基因组水平的系统发育分析。获得的主要结果如下：
1.隆额网翅蝗线粒体基因组基因组成与基因排列
隆额网翅蝗线粒体DNA序列全长15783bp，包括13个蛋白质编码基因，2个核糖体基因，22个转运RNA基因，及1个长894个碱基的A+T丰富区，全线粒体基因组的A+T含量为76.4%。其基因排列顺序与非洲飞蝗的一致。隆额网翅蝗线粒体基因组在8个基因之间共有36bp的重叠区域，重叠范围在1bp到8bp之间变化。有114bp的基因间隔区，它们分散在20个基因之间，最长的间隔区长21bp，短的只有2bp。A+T丰富区位于核糖体12S小亚基和tRNAIle基因之间，A+T含量为86.0%，包括894个碱基，比其他昆虫的短一些。
2.隆额网翅蝗线粒体基因组蛋白质编码基因
隆额网翅蝗的密码子总数为3718，与非洲飞蝗的密码子（3713）总数接近。隆额网翅蝗编码基因的A+T含量为75.8%，它比非洲飞蝗的编码基因A+T含量高约1.7%。除COⅠ基因外，隆额网翅蝗的蛋白质编码基因的起始密码子都是典型的ATN密码子。其中ND2、COⅡ、ATP6、COⅢ、ND4L、ND6、Cyt b这7个基因使用ATG作为起始密码子，ATP8、ND3、ND5基因使用ATT，ND4和ND1基因分别使用ATC和ATA。除COⅡ、ND5、ND4和ND1外，其他基因都是以TAA为终止密码子。亮氨酸Leucine（13.88%）、异亮氨酸isoleucine（10.87%）、丝氨酸serine（9.71%）、苯丙氨酸phenylalanine（9.23%）是隆额网翅蝗线粒体蛋白质中使用频率最高的4种氨基酸，总计占43.69%。
3.隆额网翅蝗线粒体基因组tRNA基因及tRNA二级结构
隆额网翅蝗线粒体DNA编码的22个tRNA基因零散分布于整个基因组中。从预测的二级结构来看，除tRNASer(AGN)外，所有tRNA都具有典型的三叶草结构。tRNASer(AGN)中，双氢尿嘧啶（DHU）臂只是形成了一个简单的环。tRNA的氨基酸接受臂，反密码子环和反密码子臂较为保守，TΨC和DHU臂变异比较大。
4.隆额网翅蝗线粒体基因组rRNA基因结构
隆额网翅蝗mtDNA 16S rRNA基因长1317bp，12S rRNA基因长842bp，它们分别位于tRNAVal基因和A+T丰富区及tRNALeu（CUN） 和tRNAVal之间。大亚基的长度相对其它物种而言适中的，但是12S小亚基的长度却仅次于最长的Petrobius brevistylis 845bp核糖体小亚基。
5.隆额网翅蝗、非洲飞蝗和东方蝼蛄线粒体基因组比较分析
隆额网翅蝗、非洲飞蝗和东方蝼蛄的序列长度和碱基组成比较接近，但是隆额网翅蝗和非洲飞蝗之间更加相近。这三种昆虫蛋白质编码基因序列比较发现，细胞色素氧化酶的3个亚基（COⅠ、COⅡ、COⅢ）是较为保守的基因，其中COⅠ是最保守的基因。ND1、ND4、ND4L、ND5、ATP8相对变异较大，ND4和ND4L是13种蛋白质编码基因氨基酸序列变异最大的两个基因。
12S rRNA序列较16S rRNA更保守。从序列之间的核苷酸差异可以看出12S基因比蛋白编码基因还要保守，而16S基因较细胞色素氧化酶亚基（COⅠ、COⅡ、COⅢ）的进化快些，但比其他蛋白编码基因保守。蛋白质编码基因和12S基因比较结果发现隆额网翅蝗与非洲飞蝗之间的亲缘关系较近，而16S基因则支持隆额网翅蝗与东方蝼蛄之间分歧更小，这种结果有可能是分析过程中导入的误差。
A+T丰富区比一些蛋白编码基因序列之间的差异还小，可能是由于在A+T丰富区中发生了多重替换，对分析结果产生误导。所以用A+T丰富区的序列数据来比较直翅目这三个种之间的亲缘关系还有待考虑。
6.8种多新翅类昆虫线粒体DNA系统进化分析
将8种多新翅类昆虫线粒体蛋白质编码基因连接成一个联合数据集。采用NJ和MP分析方法建树，所得拓扑结构很类似，只是G.orentalis与（L.migratoria+A.coreana）以及S.paresisensis、T.californicum和G.sculleni分枝间的次序不同。L.migratoria和A.coreana同属直翅目蝗亚目，它们之间的单系性得到很高的bootstrap支持（bootstrap都是100）。与它们同为直翅目属于螽亚目的东方蝼蛄与这两个物种之间的亲缘关系比较远，在MP树与NJ树中它的分支次序不同。
螳（虫修）目的S.paresisensis、竹节虫目T.californicum和蛩蠊目G.sculleni在NJ法和MP法建树中都聚为一枝，但这三者之间的具体关系则不明确。在此次分析中，蜚蠊目P. fuliginosa和螳螂目T.tamola在NJ树和MP树都以很高的自举值聚合在一起，这与NCBI分类基本一致。
该项目为导师黄原教授所承担的国家自然科学基金项目的重要组成成分，首次从比较及进化基因组学角度对隆额网翅蝗的线粒体基因组进行详细的基因组织结构和序列进化的研究，可为理解线粒体基因组结构和序列进化提供重要线索和数据，也为用完整线粒体基因组序列大规模地研究直翅目高级阶元之间的系统发育关系奠定了基础。同时本项目研究中所设计的一套通用引物，可以成功扩增出相互覆盖的直翅目昆虫全线粒体基因组，建立起对直翅目昆虫全线粒体测序工作的平台，能够快速、精确地完成更大量蝗总科昆虫的全线粒体测序工作，为尽早实现从全线粒体基因组水平完整研究直翅目系统发育关系提供重要保证。因此，该论文在比较及进化基因组学、分子进化和分子系统学领域将具有重要的实践价值和理论意义。