● 摘要
人类文明的进步并未阻止传染病的肆虐，进入二十一世纪，传染病的防治仍是人类必须面对的巨大挑战。对传染病病原学的研究始终是一项具有重大意义的任务。近年来，生物学技术的迅速发展也使得传染病病原体的检测与鉴定技术得到飞速发展，每一项技术的革新对生命科学领域来说都是一次跨越。目前，众多分子生物学方法已成功应用于病原体检测中，如PCR技术、基因芯片技术、分子杂交技术等。相对于传统检测技术而言，新一代分子生物学技术具有操作简单、耗时短、检测效率高等特点，但是也存在相应的不足，如何避免这些不足并开发新技术已成为目前科研工作者的首要任务。在本研究中，我们将最初用于基因分型、突变位点检测、耐药位点分析等方面的多重PCR-Mass ARRAY技术应用于传染病病原体的高通量检测中，以15种可引起脑炎/脑膜炎症状的病原体以及16种可引起病毒性出血热的病毒为研究对象，建立脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术，实现此类病原体的多重、高通量、高特异性以及高灵敏度检测，服务于流行病学调查研究以及传染病病原体大规模筛查与鉴定。
实验方法：针对拟检测病原体，使用生物信息学方法对待检病原体的基因组序列进行分析，确定各病原体的保守序列；以保守序列为参考序列，设计PCR-Mass ARRAY的扩增引物组合和延伸引物组合（每种病原体包括一对扩增引物和一条延伸引物）；使用无菌双蒸水、正常人基因组DNA以及人工重组质粒对引物体系的特异性以及可重复性进行验证；使用梯度稀释的质粒对该体系的灵敏度进行测定。在优化并建立了脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术体系之后，使用6种脑炎培养病毒以及14份脑炎症状的临床标本对该体系的实际检测效果进行评价。同时，使用实时荧光定量PCR技术、Sanger测序法对同批样本进行平行检测，以评价多重PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度以及准确性。
结果与结论：（1）建立的脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术具有很高的特异性，最终确定的检测体系不出现假阳性和非特异延伸；对梯度稀释后的重组质粒进行多重PCR-Mass ARRAY检测，确定各质粒的检测灵敏度，脑炎/脑膜炎病原体质粒的灵敏度范围为100 copies/μl—10000copies/μl，且只有两种病原体的灵敏度为10000copies/μl； 6种脑炎纯病毒的检测结果显示各病毒cDNA均可检出，没有假阳性，Sanger测序结果与多重PCR-Mass ARRAY的检测结果一致；对14份脑炎症状的临床样本多重PCR-Mass ARRAY检测结果显示，有3份样本检测到流行性乙型脑炎（JEV），其余样本各种病原体检测均为阴性。使用荧光定量PCR法对同批样本进行平行检测，检出两份JEV，这两份样本的PCR-Mass ARRAY结果也为JEV阳性，应用Sanger测序法对3份阳性样本进行鉴定，证实3份样本均为JEV阳性，证明PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度高于荧光定量PCR技术。（2）建立的16种出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术同样具有很好的特异性与可重复性；分别使用梯度稀释的出血热病毒重组质粒对该技术的灵敏度进行测试，测试结果显示质粒的灵敏度范围为10 copies/μl—100copies/μl，大部分质粒灵敏度为100copies/μl，证明所建立的出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY技术具有很高的灵敏度。上述实验结果表明：多重PCR-Mass ARRAY在脑炎/脑膜炎病原体以及出血热病毒的检测中具有良好的特异性与可重复性，并具有比较高的灵敏度与准确度。因此，该技术适合应用于流行病学调查研究与传染病病原体的大规模筛查中。