题目：ANXA2对caco2细胞生物学行为的影响

结直肠癌是严重威胁人类生命健康的消化道疾病,ANXA2是钙磷脂结合蛋白Annexin超家族的成员之一，在细胞中以单体、异源二聚体、异源四聚体三种形式参与膜形成、膜转运、胞吞、胞吐、细胞增殖、信号转导、分化及凋亡等一系列重要的生命过程。近年来众多的研究已经证实ANXA2的表达失调与多种肿瘤的发生发展密切相关，其表达在人类绝大多数肿瘤中均上调，这种过表达现象与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后差等密切相关。基因敲除技术（Knockout）是基于基因同源重组技术、胚胎干细胞技术基础上的一种新的分子生物学技术，其高效性、特异性的特点，使其发展成为基因功能研究强有效的手段，具有广阔的应用前景。本论文在综合国内外研究进展的基础上，采用Knockout技术，从基因组水平彻底去除靶基因表达，建立完全无ANXA2表达的caco2细胞系（ANXA2-/-caco2），通过细胞增殖、迁移、凋亡变化了解ANXA2基因对caco2细胞生物学行为的影响。在无ANXA2表达的实验环境中采用Western blot、RT-PCR方法检测S100A10、tPA、FAK、β-actin的表达水平变化，分析它们在结直肠癌细胞生长、增殖、浸润与转移过程的作用，探究ANXA2与S100A10、tPA、FAK、β-actin的关系与功能及其可能的作用机制，试图寻求在结直肠癌发展过程中涉及的相关信号通路，为进一步探索ANXA2在结直肠癌发生、发展过程中的作用机理以及其在肿瘤发展过程中的调节作用积累资料。
方法：
1. Western blot方法鉴定无ANXA2表达的caco细胞系（ANXA2-/-caco2）。
2. MTT法检测caco2细胞活性，分析ANXA2在不同时间点（24h，48h，72h，96h，120h）对caco2细胞增殖能力的影响。
3. 采用损伤修复法检测ANXA2表达对caco2细胞运动力的影响。
4. 以Hoechst33342染色、MitoViewTM633染色结合流式细胞仪检测靶向ANXA2基因敲除对caco2细胞凋亡的影响。
5. 采用RT-PCR、Western blot检测S100A10、β-actin、FAK、tPA表达水平的变化，分析ANXA2对相关基因表达水平的影响。
结果：
1. Western blot方法进一步确定敲除细胞系（ANXA2-/-caco2）构建成功。
2. MTT法结果显示：敲除ANXA2基因，caco2细胞的增殖能力受到明显抑制(**P<0.01) 。
3. 损伤修复法结果显示：无ANXA2表达的caco2细胞，迁移能力明显下降，48h后抑制显著（*P<0.05）。
4. Hoechst33342染色、MitoViewTM633染色结合流式细胞仪检测结果显示：ANXA2基因的表达对caco2细胞凋亡没有显著影响。
5. RT-PCR、Western blot结果显示：敲除ANXA2显著抑制S100A10、tPA的表达水平(**P<0.01)，而β-actin、FAK表达没有发生明显变化(P>0.05)。
结论：
ANXA2与人结直肠癌caco2细胞的生长、增殖及运动力密切相关，抑制ANXA2的表达可有效降低caco2细胞的增殖力和体外迁移能力，但对凋亡现象没有显著影响。且ANXA2的去除显著抑制S100A10、tPA的表达（**P< 0.01），但FAK、β-actin的表达水平无明显差异（P>0.05）。本研究结果在靶基因敲除的条件下从更加客观、准确的角度进一步阐释ANXA2对caco2细胞生物学行为的影响。通过检测S100A10、tPA、FAK、β-actin的表达水平变化，发现S100A10、tPA、FAK、β-actin也参与caco2细胞的生长、增殖、浸润与转移过程，且ANXA2可与S100A10、tPA、FAK、β-actin直接或间接作用，共同调节结直肠癌的发生、发展过程，提示ANXA2具有成为结肠癌基因治疗或药物治疗新靶点的潜在性。
 
关键词：膜联蛋白A2，结直肠癌，细胞行为，S100钙结合蛋白A10蛋白，组织纤溶酶原激活因子，黏着斑激酶，肌动蛋白