● 摘要
甘肃鼢鼠(Myospalax cansus)为我国特有营地下生活鼠类，由于地下洞道气体环境为典型的低氧、高二氧化碳，长期的进化使其形成了一系列适应性机制，成为研究低氧适应的理想动物。研究表明，当机体处于低氧环境时，一系列的应激反应会导致活性氧自由基(R0S)的增多，使机体处于氧化应激状态，而抗氧化系统有清除自由基、维持氧化-抗氧化体系平衡等功能，是机体内重要的氧化防御系统。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion Peroxidase, GPx)是生物体内最重要的三大抗氧化酶系，其中，GPx亦属硒酶。有关地下鼠抗氧化系统在低氧适应中的机制研究还不是很充分。
本研究利用生物化学方法测酶活，比较研究甘肃鼢鼠和SD大鼠在常氧、急性低氧和慢性低氧条件下脑和肝组织中SOD、CAT、GPx三种抗氧化酶的活性，及组织的总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量；利用实时定量PCR技术，测定SOD1、CAT、GPx1三种抗氧化酶的mRNA表达量；利用RT-PCR技术克隆甘肃鼢鼠GPx1基因cDNA序列，并根据Gengank、PDB、Pfam、ExPASy、MART、ConSurf等数据库信息，对核苷酸序列和氨基酸序列进行同源建模、结构比对、功能位点、系统进化树、选择压力等生物信息学分析。以此探讨抗氧化酶在机体低氧应激时的表达情况，及甘肃鼢鼠不同于其它地面鼠的抗氧化防御机制，为生物体的低氧适应研究提供理论依据。主要实验结果如下：
1.SOD、CAT、GPx活性、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量
急性低氧条件下，脑中甘肃鼢鼠SOD、CAT活性和T-AOC均有不显著升高(P>0.05)，GPx活性显著升高(P<0.05)，MDA含量下降但不显著(P>0.05)，SD大鼠变化不明显；肝中甘肃鼢鼠SOD和CAT活性显著升高(P<0.05)，GPx活性和T-AOC升高但不显著(P>0.05)，MDA含量显著下降(P<0.05)，SD大鼠CAT和GPx活性显著升高(P<0.05)，MDA含量略有下降，其它变化不显著。慢性低氧条件下，脑中甘肃鼢鼠SOD、CAT、GPx活性均显著升高(P<0.05)，T-AOC和MDA变化不显著(P>0.05)，SD大鼠GPx活性显著升高(P<0.05)，其它变化不显著；肝中与急性低氧组变化基本一致。说明急、慢性低氧条件在一定程度上能够刺激脑和肝中抗氧化酶活性的增加，稳定总抗氧化能力，抑制MDA过量生成。与常氧组相比，慢性低氧组酶活性的升高较急性低氧组显著；甘肃鼢鼠酶活性的升高和MDA含量的降低较SD大鼠显著，其抗氧化系统对低氧环境有更强的适应性。
三种氧条件下，甘肃鼢鼠和SD大鼠脑组织SOD活性无显著差异(P>0.05)，GPx活性极显著低于SD大鼠(P<0.001)，CAT活性常氧组无显著差异(P>0.05)，但在急、慢性低氧后，甘肃鼢鼠显著高于SD大鼠(P<0.05)，T-AOC及MDA含量差异不显著。肝组织SOD活性常氧组无显著差异(P>0.05)，急、慢性低氧组甘肃鼢鼠显著高于SD大鼠(P<0.05)，CAT活性常氧组和急性低氧组无显著差异(P>0.05)，慢性低氧组甘肃鼢鼠极显著低于SD大鼠(P<0.01)，GPx活性极显著低于SD大鼠(P<0.001)，T-AOC显著高于SD大鼠(P<0.05)，MDA含量差异不显著(P>0.05)。说明甘肃鼢鼠和SD大鼠抗氧化模式不同，脑中二者的抗氧化能力相当，肝脏中甘肃鼢鼠抗氧化能力远高于SD大鼠，甘肃鼢鼠抗氧化主要依靠SOD和CAT，GPx参与脑组织的抗氧化，SD大鼠脑和肝中GPx均发挥重要抗氧化作用。此外，虽然甘肃鼢鼠脑中GPx活性在急、慢性低氧中都显著升高，但活性极显著低于SD大鼠。
2.SOD1、CAT、GPx1 mRNA表达水平
急性低氧条件下，甘肃鼢鼠除脑中SOD1 mRNA表达量显著升高(P<0.05)，SD大鼠肝中CAT显著升高(P<0.05)外，其他均无显著变化。慢性低氧条件下，脑中甘肃鼢鼠SOD1、CAT、GPx1 mRNA表达量均显著升高(P<0.05)，SD大鼠除GPx1显著升高(P<0.05)外，其他无显著变化；肝中甘肃鼢鼠和SD大鼠SOD1和CAT mRNA表达量均显著升高(P<0.05)，GPx1无显著变化(P>0.05)。说明慢性低氧比急性低氧更能刺激抗氧化酶基因的转录，另外，低氧应激下甘肃鼢鼠抗氧化系统在mRNA表达量上亦表现出更强的适应性。进一步比较甘肃鼢鼠和SD大鼠mRNA表达水平，甘肃鼢鼠脑和肝中SOD1 mRNA表达量极显著高于SD大鼠(P<0.001)，CAT和GPx1极显著低于SD大鼠(P<0.001)，说明SOD是甘肃鼢鼠体内抗氧化系统的主要功能物质。
3. GPx1基因克隆及生物信息学分析
甘肃鼢鼠GPx1基因全长序列长度780bp，包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)，ORF长度606bp，编码201个氨基酸，硒代半胱氨酸密码子TGA位于氨基酸序列第47位，mRNA链中检索到I型硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)。核苷酸和氨基酸序列比对结果表明，在哺乳动物中甘肃鼢鼠GPx1基因序列与盲鼹形鼠相似度最高。
甘肃鼢鼠GPx1蛋白一级序列中负电荷氨基酸22个，正电荷氨基酸23个，相对分子质量22.3KD，理论等电点 pI=7.67，分子式C997H1556N278O286S8Se1，为不稳定蛋白。二级结构以螺旋(Helix)、折叠(Strand)、环(Loop)为主要元件，构成混合型(mixed)结构，无信号肽及跨膜区，无二硫键。三级结构显示GPx1蛋白由四组结构相似的亚单位构成。
对二级结构的功能域和功能位点分析发现，甘肃鼢鼠GPx1氨基酸序列第14-128位氨基酸残基为谷胱甘肽过氧化物酶功能域，第35-50位为活性位点，第72-79位为保守位点，该序列还包含AhpC-TSA家族蛋白、ENT、GAS2等结构域。另外，GPx1蛋白与硫氧还蛋白还原酶(TrxR)家族匹配度极高，二者同属硒酶，提示蛋白质结构与功能相一致。
蛋白进化分析表明，甘肃鼢鼠GPx1基因主要经历纯化选择，保守性较强，但又存在功能分化和正选择位点。其中，地下鼠和地面鼠间存在显著的功能分化，后验率超过0.98(QK>0.98)的氨基酸功能分化决定位点有4个，分别是2 Cys、10 Gly、158 Ile和199 Gly；另外，通过位点模型检验和贝叶斯法，预测出4个可能受正选择压力作用的氨基酸位点，分别是129 Glu，147 Phe，199 Gly，200 Ser。这些位点可能解释甘肃鼢鼠抗氧化酶基因对地下生活的适应性进化。