题目：应用逆转录病毒载体和腺病毒载体介导外源基因导入多种靶细胞

癌症的基因治疗作为一种全新的治疗手段已进入临床试治阶段，引起人们的极大关注。而最终能否成功，能否在临床上推广，很大程度上取决于能否建立一套安全、有效、简易的基因转移系统。目前，基因转移的方法已有理化法和病毒法，其中，以病毒感染法尤其是腺病毒和逆转录病毒载体介导的基因转移方法更为常见，较为有效。 本文应用包装标志基因LacZ（大肠杆菌β--glycosidase）基因的逆转录病毒和腺病毒载体，转染人或小鼠的白血病、食管癌、胃癌、黑色素瘤等癌细胞，成纤维细胞以及原代细胞等12种靶细胞，以X-gal 黑色反映测定LacZ基因的导入效率，比较了两种病毒载体的几个特点，建立了检测病毒滴度的简便方法与经典方法，并探讨了影响基因导入效率的诸多因素。 结果表明：1、包装LacZ基因的逆转录病毒产生细胞MLZ与ψLZ,引进时测其滴度为 0﹒1~7.7*10^6CFU/ml；当传代20代以后，测其滴度将为0.5~1.6*10^4CFU/ml,以上述两种滴度的病毒分别转染K562细胞，其导入效率分别为96﹪和20﹪左右，差异极其显著，说明导入效率和病毒滴度呈正相关。2、测得SR、EF、CA三种不同启动子的腺病毒滴度分别为2*10^9、0.8*10^9和0.4*10^9CFU/ml。3、腺病毒的转染效率因靶细胞而异，高者可达90~100﹪,一般在70﹪以上，只有少数细胞很低，总趋势是随重复感染率（multiplicity of infection, m.o.i）的增高而上升；4、腺病毒载体介导的LacZ基因不仅能导入分裂细胞，而且还能导入Go期等非分裂细胞；但随靶细胞增殖，LacZ基因表达逐渐下降，约2周左右即趋近于0。5、在相同的m.o.i下，不同启动子腺病毒的转染率不同，一般以CA启动子病毒的转染效率的最高。6、逆转录病毒的转染效率一般比腺病毒为低，且靶细胞谱较窄，不仅不能转染非分裂细胞（如PBL细胞），而且即使分裂细胞，也因细胞特征（如靶表面逆转录病毒受体的数目、分布及细胞分裂增值旺盛与否等）不同而有明显差异。7、随着逆转录病毒转染次数的增加，其介导的LacZ基因转染效率得以显著提高，且随着转基因细胞的增殖，LacZ基因能持续表达（2个月以上）。总之，基因导入效率与靶细胞种类、病毒类型、病毒滴度、病毒重复感染率和感染次数等诸多因素密切相关。 在此基础上，本文又选用了两种具有临床治疗效果的细胞因子基因IL-2（白细胞介素2）基因和GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）基因，作为目的基因，以包装IL-2或GM-CSF基因的逆转录病毒载体ψ-CRIP系统，转染小鼠白血病、黑色素瘤和成纤维细胞。本文从细胞水平和分子水平都证明，应用本在体能有效地将IL-2基因和GM-CSF基因导入多种靶细胞，并且通过反复转染，使基因导入效率得以提高。 本文建立了检测IL-2表达水平的生物学活性检测法：CTLI-2/MTT法，该法操作过程简便，时间短，避免了放射性同位素的污染，且无需购置昂贵的设备，可直接显示转基因细胞表达有活性的IL-2的水平，值得推广，本文抽提转基因（GM-CSF）细胞的RNA,进行Northern blot杂交，从分子水平证明转基因细胞有GM-CSF基因的转录表达。此外，用酶联免疫吸附法（ELISA）定量测定了1*10^6转基因细胞培养24小时分泌于细胞培养上清中的GM-CSF浓度。实验测得GM-CSF分泌量达70000pg/10^6C/24h,IL-2分泌量达1422IU/10^6/24h，并且通过基因转移建立了若干转基因细胞株，为动物实验性基因治疗奠定了基础。