● 摘要
摘 要
中介蝮（G.intermedius）隶属于蝰科（Viperidae）蝮亚科（Crotalinae）亚洲蝮属（Gloydius），其在6种蝮蛇中属于毒性最强的一种。我国的中介蝮主要广泛分布于西北地区（主要在甘肃、青海、新疆、宁夏及陕北等地）和华北部分地区（山西北部、内蒙古及黄土高原一带），国外分布在与我国相邻的蒙古共和国和西伯利亚南部。蛇毒在基础科学研究和医学药理学方面有重大的应用价值，本实验室以前都是研究蛇毒素蛋白在原核细胞中的表达，但原核表达的产物易形成包涵体形式且复性较为困难，不利于产物的进一步纯化和活性的研究。鉴于此，本研究拟采用酵母表达系统尝试表达蛇毒素蛋白——蛇毒丝氨酸蛋白酶（SVSPs）。
我们通过聚合酶链式反应（PCR）扩增来源于中介蝮毒腺cDNA文库中的GI-TLE1（thrombin-like enzyme1）基因，将其克隆到酵母表达载体pPICZαA中，经PCR筛选和测序证实，表明成功构建了一个重组的真核表达载体。接着用SacⅠ将其线性化，分别电转化毕赤酵母GS115和KM71，同时用含Zeocin依次为100μg/mL，200μg/mL，300μg/mL浓度梯度的YPDZ平板筛选高拷贝转化子。对筛选获得的GS115高拷贝转化子进行整型鉴定，结果表明GS115转化子均为Mut+表型。然后分别提取GS115和KM71转化子的重组基因组DNA，经PCR鉴定目的基因已成功整合至其基因组中。在诱导表达阶段，我们选择28℃，250rpm/min，0.5%的甲醇进行诱导表达，同时对诱导时间进行摸索，分别在0h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h取样，然后每隔24h添加诱导物0.5%甲醇以维持诱导，经SDS-PAGE分析显示GS115在36h和48h时有表达产物，KM71均没有表达产物。随后对甲醇添加量进行优化，分别选择0.5%、1%和1.5%三个诱导浓度，结果显示在0.5%时GS115和KM71上清液中分泌的总蛋白含量最大。最后，以BApNA为底物对表达产物的酰胺水解酶活性进行了鉴定，但由于表达量太低，反应溶液的颜色变化不是很明显，不能初步定性地判断表达蛋白是否具有生物活性，要具体定量地分析其活性大小需提高表达量后经Ni2+-IDA resin亲和层析柱纯化出目的蛋白后进行。本实验的研究结果为蛇毒蛋白在毕赤酵母中的表达提供了参考和奠定了基础。
关键词：中介蝮，蛇毒，SVSPs，GI-TLE1，酵母表达
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