题目：拟南芥蔗糖磷酸合成酶基因克隆及其功能研究

蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳运输的主要形式，也是“库”代谢的主要基质。它具有信号功能，可以诱导或抑制某些基因的表达，是细胞代谢的调节因子之一。植物蔗糖磷酸合成酶(Sucrose-phosphate synthase, SPS, EC 2.4.1.14)是存在于细胞质中的一种可溶性酶，很久以来被认为在蔗糖合成过程中扮演重要的调控角色，是催化蔗糖合成的关键酶，SPS调节碳的分配，影响果实的糖代谢以及成熟与衰老，并参与细胞分化与细胞壁纤维素的合成。
本课题以模式植物拟南芥SPS为研究对象，从拟南芥中克隆得到SPS基因，并构建SPS基因的RNA干涉载体，采用农杆菌介导的真空转化法转化拟南芥并获得转基因植株，对转基因拟南芥植株进行了相关的分子生物学鉴定及表型分析，同时，利用生物信息学方法对拟南芥等植物中SPS基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列特征进行了分析。主要实验方法和结果如下：
1. 从拟南芥哥伦比亚野生型(Arabidopsis thaliana Columbia ecotype)植株中克隆出SPS的cDNA序列，将其克隆入T载体，经菌落PCR检测、不同限制性内切酶酶切检验后进行DNA序列测定，测序结果与目的基因At5g20280的相似性为99%，该cDNA序列长3287 bp，开放读码框包含3132 bp核苷酸，编码1043个氨基酸。
2. 在获得的SPS cDNA序列3’端非保守区域，选择188 bp作为RNA干涉片段，构建SPS基因RNA干涉表达载体，该载体经PCR检测与多种限制性内切酶酶切验证，其结果均与预期相符，表明RNA干涉载体构建正确。
3. 将SPS基因RNA干涉载体转入农杆菌GV3101中，并通过农杆菌介导的真空转化法转化拟南芥哥伦比亚野生型植株，获得转基因拟南芥T0代种子；将转基因拟南芥T0代种子在含有卡那霉素的MS筛选培养基上进行无菌培养，获得转基因抗性植株。
4. 提取转基因抗性植株与野生型对照植株的总RNA，使用实时定量PCR方法检测并比较SPS基因在转基因植株与野生型植株中的表达情况后发现，该基因在转基因植株中表达量明显下降，为野生型的8.7%-26.4%，说明RNA干涉载体转入拟南芥植株后，有效的抑制了该基因的表达。
5. 对比观察转基因抗性植株与野生型对照植株表型发现：转基因植株萌发时间较野生型约晚1 d，转基因拟南芥植株与野生型对照植株在分裂旺盛的组织如根和幼叶中表型出现了明显差异，对MS培养基中萌发约14 d的56棵野生型拟南芥幼苗和53棵转基因幼苗统计根长，结果表明野生型拟南芥幼苗平均根长2.94 cm，转基因拟南芥苗平均根长1.27 cm，所有野生型拟南芥均有侧根产生，且侧根数较多，而转基因型拟南芥只有23%的幼苗具有侧根。转基因植株在高度、根长和叶片大小等方面明显小于野生型拟南芥，其侧根数与叶片数目较少，植株生长状态也较野生型对照植株差，说明RNA干涉表达载体转入植株使SPS基因表达下调后明显地影响了拟南芥植株的生长。
6. 采用生物信息学方法对已在GenBank上注册的拟南芥等植物的SPS基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列进行分析，对其组成成分、导肽、跨膜拓朴结构、疏水性/亲水性、蛋白质二级结构及功能域等进行预测和推断的结果表明：这些植物SPS的编码核苷酸序列与氨基酸序列的组成成分与理化性质基本一致，不存在导肽，为位于细胞质中非跨膜的亲水性不稳定蛋白，α-螺旋和不规则卷曲是其蛋白质二级结构的主要结构元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中，其中拟南芥SPS二级结构由38.16%的α-螺旋、16.01%的延伸链、9.49%的β-转角和36.34%的无规则卷曲组成，这几种植物SPS均包含三个功能结构域。