题目：我国多斑按蚊复合体的分子鉴别及系统学研究

蚊虫是一类重要的医学昆虫，其分类研究已有两百多年的历史，已形成了较为成熟的体系架构,但由于蚊虫中存在许多由形态相似的隐种（cryptic species）组成的种团（group）或复合体(complex)，沿用传统的方法对其分类和鉴别较为困难，因此，寻找合适的特征和方法成为新世纪蚊虫分类工作者研究的重点内容之一。上世纪八十年代以来，随着现代分子生物学的迅猛发展，生物分类学也已迈入到一个全新的发展时期。将分子生物学方法和技术应用于生物的分类鉴定，以生物大分子（即遗传本质DNA）的特征为依据进行物种鉴别，具有生物分类的根本性价值和意义，一经应用便显示出比形态学、生物化学和细胞学等更为灵敏、客观和稳定，故受到广大学者的肯定和重视。 多斑按蚊（广义）Anopheles maculatus s. l.以往被认为是单一蚊种，通过形态和细胞遗传学研究，发现它是包括至少8个亲缘种的复合体，我国已记述5种，即多斑按蚊、威氏按蚊、塞沃按蚊、达罗毗按蚊和伪威氏按蚊。由于多斑按蚊复合体成员种形态相似，其鉴别特征常有交叉重叠，种内染色体也有多型现象，因此，分类时常易混淆，各成员种间亲缘关系也无共识。本研究应用分子生物学方法和技术，对我国多斑按蚊复合体5成员种进行鉴别，并从分子水平上阐明该复合体成员种间的遗传变异，进而确立其系统发育关系。 本研究通过PCR特异扩增我国多斑按蚊复合体5成员种核糖体DNA 28S-D3区和线粒体DNA-COII基因片段，应用DNA单链构象多态（single strand conformation polymorphisms, SSCP）技术分析了5成员种的28S-D3多态现象，进行分子鉴别；随后又测定了28S-D3区和mtDNA-COII基因序列，运用PCGENE、PHYLIP和MEGA2等软件包分析其一级结构和二级结构的差异；并采用距离法、最大简约法和最大似然法构建了我国多斑按蚊复合体5成员种的系统树。获得以下结果： 1、PCR-SSCP分子鉴别我国多斑按蚊复合体5成员种，显示各成员均具种特异电泳带型，多次重复结果稳定，表明SSCP为有效的鉴别方法。分子鉴别的结果进一步证实了染色体核型研究的结果，纠正了形态鉴别的错误。 2、我国多斑按蚊复合体5成员种的28S-D3序列长度范围为388bp~394bp，GC含量为58.12%~59.79%，在种内保守，种内个体间除达罗毗按蚊的云南样本和四川样本间有1个位点突变（T?C）外，其余4种在种内个体间未发现变异，而种间存在较大差异，平均差异率为4.59%，差异最大的是达罗毗按蚊与伪威氏按蚊为6.55%，最小的是达罗毗按蚊与多斑按蚊为2.58%；二级结构分析结果显示5蚊种根据茎S2上环的数目可分为二种类型：多斑按蚊与达罗毗按蚊仅有一个顶环（C10），而威氏按蚊、塞沃按蚊和伪威氏按蚊则有一个顶环（C11）和一个茎环（C10）。mtDNA-COⅡ基因序列长度均为684bp，为一个完整的阅读框，GC含量范围为24.85%~26.02%，其中多斑按蚊、威氏按蚊和达罗毗按蚊种内个体存在差异，差异范围为0.15%~0.58%，可分别分为3、2和2个单倍型；种间序列差异较大，为3.66%~9.63%；比较其推测的氨基酸序列，威氏按蚊、塞沃按蚊、达罗毗按蚊和多斑按蚊（Macu3-5）种间无差异，而多斑按蚊（Macu1-2）和伪威氏按蚊与前者则分别有1个和6个氨基酸位点的改变。 3、依据2个分子指标，运用多种构建方法重建我国多斑按蚊复合体5成员种的系统发育关系，结果显示系统树因不同的分子指标和不同的构建方法，存在差异，综合分析所获结果，推测核糖体DNA可以提供较多的系统发育信息。 4、在前人研究成果的基础上，通过网络资源共享和分析软件的运用，首次对多斑按蚊复合体在塞蚊亚属内的系统发生关系进行分析，表明在系级水平上多斑按蚊复合体可能与新迈蚊系和迈蚊系的祖先共同起源后独立进化，而系内种间的关系仍需进一步探讨。