● 摘要
单基因遗传性疾病是由于单基因缺陷所造成的可遗传的疾病，长期以来一直困扰着人类，采用传统的疗法很难根治这类疾病。基因治疗为该类疾病的治疗提供了新的途径。目前基因治疗多是通过病毒载体如逆转录病毒载体(Retrovirus)、慢病毒载体(Lentivirus)或腺相关病毒载体(Adeno-associated virus, AAV)等将正常有功能的治疗基因导入有基因缺陷的靶细胞中，从而达到治疗目的。由于慢病毒载体或者逆转录病毒载体是随机的插入到基因组中，潜在的致癌风险限制了这种方法在疾病基因治疗中的应用。尽管AAV 是目前最佳的用于单基因疾病治疗的病毒载体，但该载体用于基因治疗仍然存在一些不足，如装载治疗基因的容量有限，由于所插入的基因并不是受其内源性启动子调控，因此所插入的外源基因在表达持续时间及表达调控方面仍然存在不足。
靶向基因组编辑技术是一种基于同源重组的可以对基因进行原位编辑的技术，理论上采用该技术可以实现对单基因遗传性疾病中缺陷基因的原位修复，因此可以从根本上治疗这类疾病。但由于自然状态下的同源重组效率十分低，大约为1/106，没有实际应用价值。由基因组编辑核酸酶介导的靶向基因组编辑技术是近几年出现的一种新的高效的靶向基因组编辑技术。利用基因组编辑核酸酶在基因组上的靶位点特异性的切割产生双链DNA断裂，引发细胞通过同源重组（Homologous recombination, HR）或者非同源末端连接 (Non-homologous end joining, NHEJ) 修复DNA，从而使靶向基因组修饰的效率提高103-105个数量级。到目前为止，基因组编辑核酸酶介导的靶向基因组编辑技术已经成功用于基因功能研究以及疾病的基因治疗研究，对人类单基因遗传性疾病治疗而言，该技术无疑是一种理想的工具。作为最早的一种产生重要影响的基因组编辑核酸酶，锌指核酸酶（Zinc finger nucleases, ZFNs）的出现对靶向基因组编辑技术产生了重要的推动作用，但是该技术仍然存在着一些问题制约着这项技术在基因治疗中的广泛的应用。本论文首先通过以下三个方面进行研究，以解决锌指核酸酶介导的靶向基因组编辑技术所存在一些不足，为该技术应用于单基因遗传性疾病的治疗奠定基础。
1. 建立一种更加敏感的筛选锌指蛋白方法
对大多数研究组来说，获得一对靶向哺乳动物基因组中某个特定位点的锌指核酸酶仍然有一定的难度。在锌指蛋白组装过程中，首先要获得左右两侧的具有对靶基因组具有结合功能的锌指蛋白。但目前由于对锌指蛋白结合能力的筛选方法不太敏感，使得一些结合能力相对较差的锌指蛋白容易被淘汰掉，因此给锌指蛋白的组装带来一些困难。此外，最近有研究表明，一侧结合力较弱的锌指蛋白可以和另一侧的一个结合力强的锌指蛋白形成一对有较好有生物功能的锌指核酸酶。因此筛选出那些结合力弱的锌指蛋白对于锌指蛋白的组装具有重要的意义，这样可以增加获得具有生物功能的锌指核酸酶的几率。为了解决该问题，我们建立了一种在哺乳动物细胞中通过报告基因表达系统来检测锌指蛋白结合力的筛选方法。这种方法的特点是在报告基因的上游插入了多个锌指蛋白所识别的靶序列（比如针对hPGRN或者hVEGF基因组的靶序列）。结果显示，这种筛选系统将筛选的灵敏度提高了将近50倍，显著的放大了不同结合力的锌指蛋白之间的差异。同时我们还发现，所获得的锌指核酸酶的靶向基因组编辑效率在一定程度上和相应的锌指蛋白的结合力呈正相关。将一个右侧的结合力较弱的hPGRN ZFR和左侧的结合力较强的hPGRN ZFL组合成一对锌指核酸酶后显示出良好的生物活性。最后，通过PCR对所编辑基因组的区域进行了扩增及测序，测序结果证实了所组装的hPGRN ZFN具有良好靶向基因组编辑能力，并且与对照组相比，hPGRN敲除的细胞系生存能力显著下降。
2. 构建在一个载体中同时携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒载体，以提高锌指核酸酶和供体DNA同时导入靶细胞的效率，从而提高同源重组的效率。
锌指核酸酶在基因组的靶位点上切割产生DSB后，细胞可以通过两种途径完成修复，一种是NHEJ途径，这种方式会造成靶位点的插入或缺失突变；另一种是在有供体DNA（Donor DNA）存在的情况下通过HR途径修复，这种修复途径会造成靶位点的纠正或者替换。对于单基因遗传性疾病的治疗必须通过HR途径才能纠正突变的致病基因，这就要求必须将ZFN和Donor同时导入到靶细胞中。在体外实验中通过转染可以达到比较高的导入效率，但对于转染效率低的细胞或者在体内实验中ZFN和Donor的导入方法仍然存在不足。在本研究中，我们构建了同时携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒载体，采用了Tet-on启动子表达锌指核酸酶，降低了病毒包装过程中由于锌指核酸酶的过量表达造成的细胞毒性，成功的获得了高滴度的同时携带锌指核酸酶和供体DNA的腺病毒。实验结果表明，在一个腺病毒载体中同时携带锌指核酸酶和供体DNA可以有效的提高将锌指核酸酶和供体DNA同时导入靶细胞的效率，实现在体外、体内对基因组DNA高效的靶向编辑。
3. 构建一种可以携带多个可线性化供体DNA片段的载体，以提高线性化供体DNA导入靶细胞的效率，从而提高同源重组的效率。
靶细胞内供体DNA与缺陷靶基因之间的同源重组效率的高低是将靶向基因组编辑技术用于单基因遗传性疾病治疗的关键。要实现高效的同源重组，除了可以通过在基因组的靶位点上切割产生双链DNA断裂以引发同源重组修复，靶细胞内供体DNA的浓度以及采用线性化的供体DNA也可以有效的提高同源重组效率。然而，不管是在体内还是体外，向靶细胞中导入线性化供体DNA的方法仍然很不成熟，由于线性化DNA转染效率比较低，体外主要通过显微注射，在体内目前还没有好的方法。在该研究中，我们开发了一种携带多个可线性化的供体DNA片段的载体，在供体DNA片段之间插入锌指核酸酶的靶序列，当该载体和锌指核酸酶表达载体共转染到靶细胞中后，锌指核酸酶同时切割载体上的靶序列和基因组上的靶序列，能够在靶细胞内释放出多个线性化的供体DNA片段，从而提高锌指核酸酶介导的同源重组效率。我们发现对供体DNA的线性化能够将同源重组的效率提高将近10倍，携带4个拷贝的可线性化供体DNA的载体可以将同源重组效率提高近30倍。为了使该技术在单基因遗传性疾病的基因治疗具有应用价值，我们还将该方法引入到腺病毒载体中，获得了同样的效果。
在锌指核酸酶之后，转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）和RNA引导的核酸酶（RNA-guided nucleases, RGNs）相继出现，同ZFNs相比较，这两种基因组编辑核酸酶在筛选及构建方面具有其独特的优势，因此得到了广泛的推广和应用。为了将新出现的核酸酶技术应用到单基因遗传性疾病的基因治疗中，我们将课题组所建立的在一个腺病毒载体同时携带锌指核酸酶和供体DNA的方法以及在同一个载体中携带多个可线性化供体DNA片段以提高同源重组效率的方法应用到了TALENs和RGNs技术中，并在携带β-葡萄糖醛酸苷酶（β-Glucuronidase，由GUS基因编码）缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast, MEF）细胞中进行了对突变的致病基因GUS的原位修复实验研究，实验结果表明，所获得的靶向突变的GUS基因的TALENs及Cas9-sgRNA可以对靶基因实施有效的切割，并可以介导对MEF中缺陷的GUS基因进行原位修复。综上所述，我们在建立敏感的锌指蛋白结合活性的筛选方法、锌指核酸酶和供体DNA运载体的构建、通过提高靶细胞内线性化供体DNA的浓度来提高靶细胞内基因同源重组效率三个方面进行了研究，进一步完善了锌指核酸酶技术应用中存在的一些问题，目的是要达到方便快速的锌指核酸酶组装和筛选、可应用于基因治疗的高效的基因组靶向修饰。同时我们还验证了我们所建立的方法在TALENs和RGNs技术中的通用性，并在GUS缺失小鼠MEF中进一步验证了我们建立的方法在缺陷基因原位修复中的治疗效果，为最终单基因遗传性疾病的基因治疗奠定坚实的基础。