● 摘要
丹参Salvia miltiorrhiza Bunge是一种著名的药用植物，在中国境内广为种植。作为传统中药之一，丹参的根（也称为“丹参”）在中国、美国、日本等地区被广泛应用于心脑血管、月经不调以及各种炎症等疾病的治疗。现代药理学研究表明，丹参的活性物质分为两大类：一类为脂溶性的丹参酮类化合物，包括丹参酮I和丹参酮IIA等；另一类为水溶性的酚酸类物质，包括迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸以及丹参素等。鉴于传统中医以水煎服的用药方法，以及水溶性成分的显著药理活性，丹参水溶性酚酸类物质已成为目前研究的热点。已有实验表明，苯丙烷类代谢途径的中间产物如咖啡酸等参与丹参水溶性物质的合成。本论文以苯丙烷类代谢途径的第一个关键酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）为研究对象，进行基因克隆，并采用RNAi的手段对该基因的功能进行研究，初步探讨了苯丙氨酸解氨酶基因与丹参生长发育及次生代谢物合成之间的关系，为阐明丹参主要水溶性成分合成的分子机理提供资料，同时也为进一步利用基因工程改良丹参品质、提高丹参有效成分含量奠定基础。主要研究方法与结果如下：
1.利用DNA Walking的方法从DNA水平克隆获得了一条丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的全长，Genebank注册号为：EF462460。该基因全长2758 bp，由两个外显子和一个内含子（622 bp）组成，内含子插入的位置与其它物种一致，且两端具有内含子的保守序列GT/AG。同源性分析结果显示SmPAL1基因与其它物种中已报道的PAL基因之间同源性高达80%以上。Southern 杂交结果显示丹参苯丙氨酸解氨酶基因是一个多基因家族，至少含有两个不同的家族成员。
2.克隆获得了约为1.0 kb的SmPAL1基因5’侧翼序列，并对转录起始位点以及TATA box等序列进行了预测。结果显示该区域含有植物苯丙烷类代谢途径启动子区的保守元件box1、 box2 ，以及G box、W box、I box、MYB recognition site 、ABA responsive element like sequence等顺式作用元件。在此基础上，利用Real-time PCR技术分析了SmPAL1基因在不同部位以及不同胁迫条件下的表达情况。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达，其中以叶中表达量最高。苯丙氨酸解氨酶是诱导酶，多种环境因素均可影响SmPAL1基因的表达，其中ABA、损伤、脱水可诱导该基因的表达，而黑暗则抑制SmPAL1基因的表达，低温对该基因的影响不明显。
3.构建了SmPAL1基因的原核表达载体，并在Escherichia coli M15菌株中进行了表达。SDS-PAGE分析显示，重组蛋白分子量约为77 kDa，与预测的该基因编码产物的分子量相吻合。酶活性检测显示重组蛋白具有较高的苯丙氨酸解氨酶活性，其发挥作用的最适温度为60℃，在硼酸缓冲液中的最适pH为8.7。
4.选取SmPAL1基因3’端一段长为217bp的片段作为靶片段，构建RNAi载体pSmPAL1。利用农杆菌介导的叶盘转化法转化丹参，经50mg/l卡那霉素筛选以及PCR检测获得了25株阳性RNAi株系，转化效率为69.4%。进一步分析显示，RNAi植株中SmPAL1基因的表达量均明显下降，而丹参苯丙氨酸解氨酶基因家族的另一成员SmPAL2基因的表达情况则因植株而异。
5.对阳性RNAi植株的表型进行了观察，与对照植株相比，RNAi植株表现出矮小、生根时间延缓以及叶和茎的表面出现坏死斑等异常表型，一些植株在培养过程中死亡。此外，用间苯三酚对RNAi植株的茎切片进行染色，发现RNAi植株中木质素的含量表现出不同程度的下降。
6.利用Folin-Ciocalteu试剂对总酚含量进行分析，结果显示，RNAi株系中总酚含量降低约30%～80%。对RNAi株系中的水溶性化合物进行HPLC分析，与对照植株相比较，RNAi株系中咖啡酸的含量明显下降，丹酚酸B的含量则略微上升。