● 摘要
摘 要
疼痛是人体一种复杂的生理和心理活动感受，是人类最常见的病证，但是目前临床上常用的镇痛药品副作用较大，所以寻找副作用小且镇痛作用强的药物就成为必需。两栖动物几乎遍及各大洲，占据着不同的生态位。两栖动物皮肤含有丰富的生物活性物质资源，如中华蟾蜍的蟾酥等常被用作传统中药。这些两栖类动物的皮肤活性物质具有很广泛的药理活性及较好的临床疗效，例如广谱抗菌、抗肿瘤、镇痛等。
前人利用热辐射甩尾实验等方法发现华西雨蛙（Hyla annectans）皮肤分泌物中有两种新型镇痛肽，分别为analgesin a1（FLPFL）和analgesin a2（FLPIL）；东北雨蛙（Hyla japonica）皮肤分泌物中有两种新型镇痛肽，分别为analgesin-HJ（FWPVI）和analgesin-HJ（I5）（FWPVT）。这些新型镇痛肽不仅有镇痛活性，同时也有一定的抗炎效果。秦岭雨蛙（Hyla tsinlingensis）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）雨蛙科（Hylidae）雨蛙属（Hyla），为陕西秦岭特有物种。目前尚无对秦岭雨蛙皮肤活性多肽序列、生物活性的研究报道。
本研究通过3′-RACE方法构建了秦岭雨蛙皮肤镇痛肽cDNA文库，筛选获得了3种编码镇痛肽前体的cDNA序列。经NCBI的ORF finder软件预测和Blast工具比对检索，共发现3种不同的镇痛肽，分别命名为：analgesin-HT1（FWPLI）、analgesin-HT2（FWPLL）和analgesin-HT3（SLPRY）。利用生物信息软件，初步分析获得了镇痛肽的理化性质信息，analgesin-HT1和analgesin-HT2等电点pI全为5.52、不带电荷，为疏水性分子；analgesin-HT3等电点pI为8.46、带一个正电荷，为亲水性分子。
人工合成analgesin-HT1、analgesin-HT2和analgesin-HT3这3种镇痛肽，采用两种动物模型，醋酸扭体实验和热板实验，评价其镇痛效果。发现analgesin-HT2在3者中镇痛效果最好，对醋酸扭体的抑制率达48.72%，对热板实验的PMAP达31.82%。此外，本研究对秦岭雨蛙皮肤镇痛肽其他生物学活性也进行了检测。结果表明400 µg/ml浓度的秦岭雨蛙皮肤镇痛肽有一定的抑制肿瘤细胞效果，其中HT2对HepG2抑制率为55%；50 µg/ml浓度的秦岭雨蛙皮肤镇痛肽HT1能促进肥大细胞脱颗粒功能；80 µg/ml浓度的秦岭雨蛙皮肤镇痛肽全有微弱的抗氧化能力。利用膜片钳技术对秦岭雨蛙皮肤镇痛肽镇痛机制进行初步研究发现，其镇痛作用位点不在ramp激活的Na+，K+通道上，以及TRPV1通道上。