● 摘要
摘要
水溶性共轭聚合物由于其独特的共轭结构使其具有极强的光捕获能力和分子线效应，在生物传感、细胞成像、药物筛选及输送释放、疾病诊断及治疗等领域都展现出广泛的应用前景。本文以腺苷脱氨酶（ADA）为目标物，首先建立了一种基于荧光turn-on无标记的ADA检测法，然后利用共轭聚合物优良的光学性能，建立了两种基于共轭聚合物PFP的高灵敏性的 ADA检测新方法，具体工作如下所述：
一、基于荧光turn-on无标记的腺苷脱氨酶的检测研究
设计了一种发夹型腺苷适配体，建立了基于荧光turn-on无标记均相检测ADA酶的新方法。我们设计的腺苷核酸适配体，能和腺苷特异性结合形成发夹结构。未加ADA时，dsDNA嵌入剂picagreen绝大部分以游离状态存在，在490 nm激发时，在525 nm处只检测到较低的picagreen荧光信号。加入ADA后，在ADA的催化作用下腺苷转化为肌苷释放出来，发夹构象被破坏，随即与之相匹配的互补链杂化形成双链DNA（dsDNA），此时picagreen能有效嵌入dsDNA中，此时激发picagreen，其荧光信号明显增长。因此，可通过检测picagreen的荧光来简单检测ADA酶，实现了无需任何标记情况下ADA的检测。这种方法检测限可达2 U/L，并且操作简便快速，成本低。
二、基于共轭聚合物及双重荧光共振能量转移机理的腺苷脱氨酶的检测研究
为了提高检测的灵敏度，我们设计了一种新的生物传感体系，将荧光共轭聚合物的信号放大优势与适配体的高选择性结合起来，通过双重荧光共振能量转移机制，用于ADA酶的检测。在该传感体系中，以阳离子型荧光共轭聚合物PFP为信号传导体、以荧光素FAM修饰的含腺苷适配体的寡核苷酸作为探针、双链专一性荧光嵌入剂溴化乙锭（EB）作为最终的能量受体物质。首先，腺苷适配体与腺苷形成发夹型构象，加入聚芴衍生物PFP及其互补链DNAc-Fl，静电相互作用拉近了阳离子聚合物PFP与DNAc-FI之间的距离，在380nm处激发PFP时，能够发生从PFP到荧光素FAM的有效的荧光共振能量转移(FRET)，而此时EB为游离状态因此无荧光。加入ADA后，ADA酶将腺苷水解后破坏了适配体的发夹结构，同样，适配体随之与之相匹配的互补链杂化成dsDNA，此时EB有效嵌入dsDNA中，从而激发PFP能够发生从PFP到荧光素FAM，紧接着从荧光素再到EB的双重FRET。因此，通过检测FAM到EB的荧光共振能量转移效率即可检测ADA。该方法的检测限可达0.5 U/L，比绝大部分报道的方法灵敏度高，且操作简单，无需太多复杂的操作，如分离、变性、洗涤等步骤，利用该法还可进行ADA抑制剂（赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)）的检测，检测限达50 pM。
三、基于共轭聚合物及FRET/PET机理的腺苷脱氨酶的检测研究
为了进一步提高检测灵敏度以及简化检测体系，我们设计了一种基于共轭聚合物及FRET、光诱导的能量转移（PET）机理相结合的新方法用于ADA的检测，在这个传感体系中，我们首先设计了一种新的适配体：适配体的5′端用FAM标记，3′端连接三个脱氧鸟苷(Gs)作为淬灭基团。适配体和腺苷可以形成一种发夹型的结构，由于FAM标记的5′ 端和3′ 端相互靠近，通过光致电子转移PET将FAM的荧光淬灭，此时加入PFP，在380nm处激发PFP，从PFP到FAM的荧光共振能量转移效率很低。当加入ADA后，因为ADA对腺苷的水解作用导致了适配体发夹构象被破坏，适配体构象的变化使Gs远离FAM，FAM的荧光得到恢复，从PFP到FAM的荧光共振能量转移效率大大提高。这种新的生物传感体系可以通过检测从PFP到FAM的荧光共振能量转移效率，从而可简单灵敏地检测ADA，检测限可达0.3 U/L，比前两种方法灵敏度都要好。我们还研究了该方法的选择性及在复杂体系中的应用性，研究发现，该方法选择性好，即使在10%的人血清中检测限仍可达0.3 U/L。利用该法可灵敏检测ADA的抑制剂EHNA，检测限达10 pM。
总的来说，我们设计了三种不同的传感体系，用于ADA酶的灵敏检测，通过比较三种方法，发现第一种方法简单、费用低廉，但灵敏度相对较低；第二种方法灵敏度好，但体系相对第一种较复杂；第三种方法灵敏度最好，传感体系也相对简单。从实验结果还可看出，在有共轭聚合物存在下，体系的灵敏度高，进一步证实了共轭聚合物在生物传感体系中可提高检测灵敏度的优点，另外，检测在均相中进行，体系无需分离洗涤等步骤，操作简单。这三种方法为酶的抑制剂的筛选提供了新的平台，为其它酶的检测提供了新的思路。