● 摘要
研究背景及目的：
结直肠癌是位居肺癌和乳腺癌/前列腺癌之后严重危害人类健康的第三位常见恶性肿瘤，在我国结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结直肠肿瘤的化疗敏感度差，尤其是对晚期转移性结直肠癌采用传统放化疗的疗效并不理想，因此寻找不良反应小、特异性高的新方法是结直肠癌治疗的重要课题之一。
近年来光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）以其有效、安全、副作用小、可协同性、可重复性和相对成本低等优点脱颖而出，已成为世界肿瘤防治科学中最活跃的研究领域之一。第二代光敏剂二氢卟吩e6（Chlorin e6，Ce6）是叶绿素a降解衍生物之一，具有肿瘤组织选择性高及非肿瘤组织清除率高等优点；同时光毒性小，从而为Ce6介导的光动力疗法（Ce6-PDT）在临床治疗结直肠癌提供了条件。
然而目前PDT抑制杀伤肿瘤细胞的作用机制尚未完全清楚，已有研究表明PDT可以诱导细胞内p38MAPK通路的激活，p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要一员，参与细胞的存活、分化和凋亡等过程。但p38MAPK在不同细胞中对PDT的应答有所不同，不同的PDT参数也会影响其在细胞中的作用。
本研究目的在于了解Ce6介导的光动力作用于SW620细胞后其自噬和凋亡的应答及p38MAPK在SW620细胞凋亡及自噬中的作用。为结直肠癌的治疗提供重要的理论和实验基础。
研究方法及结果：
第一部分 Ce6-PDT对SW620细胞生长抑制及诱导其凋亡和自噬的研究 实验主要研究Ce6-PDT对SW620细胞存活的影响，通过形态学观察、生化分析和蛋白检测等鉴定细胞凋亡和自噬的典型特征。实验结果如下：① 噻唑蓝（MTT）比色法检测不同Ce6浓度（0.5，1，2 μg/ml）、光照强度（3，6，12 J/cm2）对SW620细胞的存活率的影响，结果显示Ce6剂量和光照强度依赖性抑制SW620细胞生长，单纯Ce6和单纯光照几乎没有细胞毒作用。② 选择固定PDT参数（3 J/cm2，0.5 μg/ml Ce6），MDC示踪自噬泡显示PDT处理后2 h胞内出现阳性自噬泡，且数量随着时间延长而增加；Western Blotting检测LC3在PDT处理后0.5 h开始转化，8 h达到极显著；加入自噬抑制剂BafA1，PDT处理后LC3Ⅱ条带明显增多，即自噬潮增加，证明Ce6-PDT可诱导SW620细胞自噬发生。③ PDT处理后，Annexin V-PE /7-AAD细胞凋亡检测SW620细胞凋亡率为15.75%；DAPI核染色显示染色质凝集；凋亡相关蛋白Caspase-3活化水平也明显提高，随时间延长剪切片段增多持续到处理后24 h。实验结果表明Ce6-PDT诱导SW620细胞凋亡及自噬的发生。
第二部分 活性氧是Ce6-PDT诱导细胞凋亡及自噬的主要机制 实验主要研究了3 J/cm2的光照强度结合0.5 μg/ml的Ce6处理后，活性氧对SW620细胞损伤的影响。结果显示：① PDT处理后，DCFH-DA检测细胞生成大量活性氧，而活性氧清除剂NAC/单线态氧抑制剂His能有效降低PDT后活性氧水平。② PDT处理前加入NAC (5 mM) /His (10 mM），荧光显微镜观察显示DAPI亮染和染色质凝集现象明显减弱；Caspase-3，PARP的活化明显降低。③ 活性氧清除剂NAC/单线态氧抑制剂His可以部分抑制LC3的转化及自噬泡的生成。④ MTT检测加入NAC/His后细胞的存活率也明显上升。实验结果显示ROS的生成是PDT细胞毒作用的主要因素，且通过激活p38MAPK调节细胞下游应答。
第三部分 MAPK通路的激活 实验研究了PDT（3 J/cm2 + 0.5 μg/ml Ce6）处理后， Western blotting检测MAPK通路相关蛋白表达变化。实验结果显示：① 与对照组相比，PDT处理后0 h，处理组细胞的p38MAPK开始活化，磷酸化水平上升，1 h表达量最高，随后表达下降；JNK磷酸化水平0 h 后也开始上升，但表达量很低，2 h后恢复正常水平；磷酸化的ERK表达基本与对照组相当。② 加入活性氧抑制剂NAC，PDT处理后p38MAPK活化明显下降；而PDT处理前加入p38MAPK抑制剂SB203580检测PDT处理后活性氧的生成量却变化不大。实验结果表明PDT处理后，细胞生成大量活性氧，并激活p38MAPK的表达。
第四部分 p38MAPK在PDT诱导SW620细胞自噬及凋亡中的作用 实验从p38MAPK抑制剂和p38MAPK干扰两种途径，通过MDC染色检测细胞自噬，Annexin V-PE /7-AAD检测细胞凋亡，Western Blotting检测自噬及凋亡相关蛋白表达，克隆形成等实验检测PDT处理前抑制p38MAPK表达后对细胞的影响。实验结果如下：① 采用抑制剂SB203580/siRNA p38MAPK抑制p38MAPK表达后，PDT处理后细胞MDC阳性绿色荧光明显增强，LC3转化增多；细胞凋亡率及Caspase-3和PARP的活化也增强。② 加入自噬抑制剂BafA1/3-MA，Annexin V-PE /7-AAD检测细胞凋亡率明显上升，且克隆形成检测细胞增殖率也明显下降。实验结果表明抑制p38MAPK表达明显加强了PDT处理后细胞的自噬及凋亡，且自噬的增强起到保护细胞的作用。
结论：
Ce6-PDT能够诱导SW620细胞凋亡和自噬的发生。PDT通过产生活性氧激活p38MAPK信号通路，而p38MAPK的活化一定程度上抑制了凋亡和自噬的发生，抑制p38MAPK表达后增强的自噬起到了保护细胞的作用。