● 摘要
腺病毒载体由于具有能感染多种类型细胞、滴度高、制备纯化相对易于操作、携带外源基因量较大且不整合到宿主细胞染色体中等优点，因此在疾病基因治疗领域中得到广泛应用。腺病毒载体是基因治疗领域最为常用的载体之一。研究一种简易有效的检测腺病毒载体的方法，不仅可以用于腺病毒载体的基础理论研究，还可以对腺病毒载体在体内治疗过程中进行动态的检测及治疗效果的评估，因此具有重要意义及实际应用价值。
腺病毒载体的标记，无论对于研究腺病毒载体杀伤肿瘤过程的示踪还是观察病毒感染宿主细胞的过程，均具有十分重大的意义。同时，腺病毒的标记为研究病毒从细胞表面向细胞核转运的过程以及进一步研究腺病毒的嗜性与生物学功能提供了重要的研究手段。
目前，腺病毒标记的方法主要包括两大类：（1）非遗传标记，这种方法将荧光染料与纯化后的病毒颗粒孵育，荧光染料与病毒的衣壳蛋白结合而将病毒标记；（2）遗传标记，该方法采用分子生物学手段修饰腺病毒基因组DNA，将荧光蛋白基因与腺病毒蛋白基因融合表达，被荧光蛋白修饰的腺病毒蛋白组装入腺病毒颗粒中而将病毒标记。这些标记腺病毒的方法在研究腺病毒与宿主细胞相互作用、示踪腺病毒感染细胞的动态过程以及评估腺病毒载体的基因转导和转录水平方面发挥了巨大的作用。
腺病毒的结构蛋白主要包括六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）、五邻体（penton base）、VIII、IIIa和pIX。蛋白pIX是腺病毒颗粒一个很小的结构蛋白组分，每个病毒颗粒中蛋白pIX的分子数目为240个，形成80个三聚体结构。六邻体构成二十面体的表面，蛋白pIX三聚体镶嵌在相邻六邻体蛋白之间，具有稳定衣壳结构的作用。蛋白pIX分子的N端锚定在衣壳上，C端在衣壳表面的外围。已有研究表明，蛋白pIX并不是腺病毒衣壳结构不可缺少的组分，缺失蛋白pIX基因的腺病毒仍然可以正常扩增，但是病毒颗粒的产量和热稳定性降低。蛋白pIX除了作为一种结构蛋白外，研究表明蛋白pIX还具有转录激活因子的作用。在体外瞬时转染分析实验中，蛋白pIX能增强腺病毒E1A（early gene 1A，E1），E4和一些晚期基因的启动子活性。目前，已有几篇关于蛋白pIX荧光蛋白标记的报道。
腺病毒的核心蛋白有V、VII、TP和mu，它们均是碱性蛋白与腺病毒基因组DNA结合形成腺病毒的核心结构。蛋白pVII是主要的核心蛋白，在三种核心蛋白中，该蛋白的拷贝数最高。蛋白pVII与DNA结合是非特异性的。核心蛋白pVII由晚期基因L2编码，前体蛋白pVII的N端23个氨基酸被腺病毒自身编码的蛋白酶剪切后形成成熟体pVII。在腺病毒感染细胞的过程中，衣壳蛋白降解后释放出腺病毒核心结构，蛋白pVII与腺病毒基因组DNA的复合体通过核孔进入细胞核。pVII-DNA复合体在调节腺病毒早期基因表达具有重要作用。目前有研究报道采用在腺病毒基因组E3区插入CMV-VII-eGFP或CMV-V-eGFP表达框来标记腺病毒核心蛋白。这样，腺病毒基因组就会编码天然的腺病毒核心蛋白和经过荧光蛋白标记的核心蛋白，被标记的核心蛋白要与天然的核心蛋白竞争结合到病毒基因组DNA上，由于标记后的核心蛋白体积增大构象变化，在与天然核心蛋白竞争时没有优势，因此获得的病毒大部分是未标记的病毒。
为了获得遗传水平上荧光蛋白标记核心蛋白pVII的腺病毒载体和病毒颗粒，本课题采用一种新的方法标记核心蛋白pVII，同时采用新的方法制备荧光蛋白标记衣壳蛋白pIX的腺病毒载体作为对照病毒。本课题具体研究内容如下：
1. 荧光蛋白标记腺病毒蛋白穿梭载体的构建
（1）衣壳蛋白pIX荧光蛋白标记穿梭载体的构建：在腺病毒E1区穿梭载体的基础上，在pIX基因的碳末端引入单一酶切位点，获得pIX蛋白标记的穿梭载体pAd5 E1-pIX shuttle。将经PCR扩增获得pIX-mCherry和pIX-eGFP基因片段通过酶切的方式替换pAd5 E1-pIX shuttle载体中的pIX基因，获得mCherry及eGFP标记pIX蛋白的穿梭载体pAd5 E1-pIX-mCherry和pAd5 E1-pIX-eGFP。
（2）核心蛋白pVII荧光蛋白标记穿梭载体的构建：将合成的含有多个酶切位点的linker连入pUC19后获得中间载体pUC19 M。将通过PCR获得pVII基因上下游同源臂克隆到pUC19 M，获得标记核心蛋白pVII的穿梭载体pUC19 M pVII shuttle。将LacZ基因的表达元件克隆到pUC19 M pVII shuttle载体，获得可以向腺病毒骨架载体引入单一酶切位点的穿梭载体pUC19 M pVII-LacZ。将通过PCR扩增获得的mCherry基因片段克隆到pUC19 M pVII shuttle载体，获得mCherry标记pVII的穿梭载体pUC19 M pVII-mCherry。
2. 荧光蛋白标记腺病毒蛋白腺病毒载体的构建
（1）荧光蛋白标记衣壳蛋白pIX腺病毒载体的构建：将经ScaI线性化的pAd5 E1-pIX-mCherry与经ClaI线性化的腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组，获得mCherry标记pIX的腺病毒质粒载体pAd5/pIX-mCherry。eGFP标记pIX的腺病毒质粒载体pAd5/pIX-eGFP构建方法与mCherry标记pIX的腺病毒质粒载体构建方法相似。
（2）荧光蛋白标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建：将经ClaI和XbaI双酶切的pUC19 M/pVII-LacZ SfuI与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组，通过蓝白斑筛选获得含有单一SfuI酶切位点的腺病毒骨架载体pAd5/pVII-LacZ SfuI；将经ClaI和XbaI双酶切的pUC19 M/pVII-mCherry与经SfuI线性化的腺病毒骨架载体pAd5/pVII-LacZ SfuI共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组，获得mCherry标记pVII的腺病毒质粒载体pAd5/pVII-mCherry。
3. 荧光蛋白标记病毒颗粒的制备：将上述腺病毒质粒载体经PacI酶切线性化后转染HEK293细胞，7-10天后收获病毒原液，经过进一步的扩增及纯化获得相应的荧光蛋白标记的腺病毒颗粒。Ad5/pIX-mCherry、Ad5/pIX-eGFP及Ad5/pVII-mCherry腺病毒的滴度分别为：3.8×1015 VP/L、2.8×1015 VP/L和2.2×1015 VP/L。
4. 荧光蛋白标记腺病毒颗粒体外实验研究
（1）标记腺病毒颗粒荧光信号的检测：将纯化后的含有2.0×1010的荧光蛋白标记的病毒颗粒置于载玻片上，于荧光显微镜100×油镜下观察标记的病毒颗粒的荧光信号。结果表明：eGFP和mCherry标记衣壳蛋白pIX的腺病毒纯化后经显微镜检测均具有较强的荧光信号。mCherry标记核心蛋白pVII的腺病毒的荧光信号较弱。
（2）荧光蛋白标记病毒感染细胞过程的动态追踪：mCherry标记衣壳蛋白pIX的腺病毒感染A549细胞后15 min后可以观察到腺病毒较为分散的分布在细胞周围，感染30 min后可以看到腺病毒聚集在细胞质中，感染1 h后可以看到腺病毒聚集在细胞核周围。eGFP标记衣壳蛋白pIX的腺病毒活力很低，不能感染A549细胞。由于mCherry标记核心蛋白pVII的腺病毒的荧光信号较弱，不能动态追踪该病毒感染细胞后在细胞中的分布情况。
5. pVII标记的腺病毒颗粒中pVII的拷贝数的分析：由于荧光蛋白标记pVII的腺病毒颗粒的荧光信号比预期的弱，我们推测经荧光蛋白标记的腺病毒颗粒中核心蛋白的拷贝数有所降低。为了分析荧光蛋白标记病毒颗粒中核心蛋白pVII的拷贝数，我们构建了pAd5/pVII-mCherry-Flag和pAd5/pVII-Flag的腺病毒质粒载体并制备病毒。将相同滴度的Ad5/pVII-mCherry-Flag及Ad5/pVII-Flag腺病毒进行Western Blot检测，一抗针对Flag标签，腺病毒衣壳蛋白knob为内参。结果表明，与对照病毒Ad5/pVII-Flag相比较，Ad5/pVII-mCherry-Flag病毒颗粒中pVII蛋白的拷贝数显著降低。
综上所述，本课题成功构建了荧光蛋白标记衣壳蛋白pIX和核心蛋白pVII的腺病毒质粒载体。将构建的腺病毒质粒载体转染HEK293细胞制备纯化获得高滴度的荧光蛋白标记的腺病毒颗粒。经荧光显微镜检测纯化后的病毒颗粒，发现荧光蛋白标记pIX的腺病毒具有较强的荧光信号。通过体外实验将mCherry标记pIX的腺病毒对其感染A549细胞的过程进行了动态追踪。mCherry标记核心蛋白pVII的腺病毒颗粒的荧光信号较弱。通过分子生物学手段及蛋白检测方法对mCherry标记pVII的腺病毒颗粒荧光信号较弱的原因进行了分析。结果表明，mCherry标记核心蛋白pVII的腺病毒颗粒的荧光信号较弱可能是pVII-mCherry融合蛋白包装进入病毒颗粒的拷贝数较少所致。