题目：丹参肌醇半乳糖苷合成酶基因（SmGols）基因的克隆及响应逆境胁迫是的功能研究

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，具有凉血消痈，通经止痛，除烦安神等功效，被广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。近年来，丹参作为研究药用植物次生代谢途径的理想材料，被誉为“模式药用植物”。伴随着对丹参主要化学成分分析及相关药理作用的研究，丹参资源的开发和利用有了较大发展，需求量也不断扩大。然而，丹参野生资源匮乏，加之人工栽培品种的品质极易受到不良生态环境的影响，导致丹参的产量和质量逐年下降。因此，挖掘丹参的抗逆基因，采用生物技术手段提高丹参抵抗不良生态环境的能力及进一步培育丹参抗逆新品种，这对于改良丹参品质提高丹参产量具有重要意义。在植物界中，植物通常会通过在体细胞内常会积累一些可溶性小分子内含物在来应对低温、干旱、高盐等逆境胁迫，这些可溶性的小分子内含物通常包括棉子糖家族寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides，RFOs）的一些成员。RFOs的生物合成起始于肌醇半乳糖苷，而肌醇半乳糖苷合成酶是植物体内合成RFOs的关键酶，该酶催化RFOs生物合成反应的第一步，它调节着RFOs代谢流中碳水化合物的分布。鉴于此，本文在已有研究的基础上，结合丹参转录组测序结果，从转录水平克隆得到3条肌醇半乳糖苷合成酶基因（Galactinol Synthase,Sm-
Gols）全长，分别命名为SmGols1、SmGols2和SmGols3，并对其基因进行序列分析及表达特征分析。进一步采用RNAi干涉技术和基因转化对该类基因的功能进行初步研究，为丹参功能基因组学的研究提供一定的数据。
主要研究内容及结果如下：
1. 分别利用RT-PCR和PCR技术分别以丹参cDNA和gDNA为模板克隆得到3条SmGols基因，其ORF分别为999 bp、993 bp和996 bp。分别比对以cDNA和gDNA为模板经PCR扩增后的产物，结果表明丹参SmGols1基因存在3个内含子(87、455和 735 bp)，SmGols2基因存在1个内含子(74 bp)，SmGols3 基因存在3个内含子(74、91和122 bp)。
2. 生物信息学显示：3条SmGoLs蛋白等电点分别为4.92、5.33和5.30；大小均约为37kDa；都为亲水性蛋白质。利用NetPhos 2.0 Server分析发现3条丹参SmGols基因都存在多个磷酸化位点。Blast序列比对结果显示3条基因与拟南芥、沙冬青、匍筋骨草等中已报道的肌醇半乳糖苷合成酶基因都具有很高的相似性，均属于糖基转移酶超家族，均与PLN00176即肌醇半乳糖苷合成酶匹配，都包含有肌醇半乳糖苷合成酶的保守功能域：即锰催化结合位点DXD基序，磷酸化结合位点以及存在于C端特殊的–APSAA–蛋白尾。
3. 利用Genome Walking的方法分别获得了SmGols1，SmGols2，SmGols3基因起始密码子上游1342 bp，1312 bp，1247 bp的5’侧翼序列。利用PlantCARE database分别对3条SmGols基因5’侧翼序列进行分析，结果表明：SmGols1基因5’侧翼序列中含有多个与植物激素诱导相关的调控元件，如响应水杨酸诱导调控元件TCA-element，响应赤霉素诱导的顺式作用元件TATC-box；SmGols2基因5’侧翼序列中亦含有响应水杨酸诱导调控元件TCA-element，另外还含有响应茉莉酸甲酯诱导的调控元件CGTCA-motif；SmGols3基因5’侧翼序列中则含有响应低温诱导的作用元件LTR。在3条SmGols基因的5’侧翼序列中还预测发现多个不同功能的MYB转录因子结合位点：如SmGols1基因5’侧翼序列中含有与光诱导相关的MYB结合位点MRE，SmGols3基因5’侧翼序列中含有与干旱相关的MYB结合位点MBS。
4. 利用实时荧光定量PCR分析3条SmGols基因的表达模式，结果显示：SmGols1基因的表达丰度高于SmGols2和SmGols3基因；SmGols1基因在老叶和茎中的表达量高于其他部位，在种子中基本不表达；SmGols2基因在老叶中的表达量略高于其他部位，在嫩叶中不表达；而SmGols3基因在主根、茎和种子中的表达量高于其他部位，在嫩叶中不表达。SmGols1 基因对渗透胁迫诱导并不敏感，而SmGols2基因和SmGols3基因则会对高渗处理立即作出响应，其中SmGols2基因在200 mM NaCl处理6 h 后的表达量会达到对照的133倍之多；SmGols1基因对干旱处理并不敏感，SmGols2基因和SmGols3基因的表达量在短期干旱处理后会立即上升，相对于SmGols1基因在长时间干旱处理的情况下变化不大，SmGols2基因和SmGols3基因的表达量在长时干旱处理情况下则会一直保持高表达；此外，3条SmGols基因的表达还受其它因素的影响：如MeJA、SA、ABA和温度等因素都可以诱导该类基因的表达。
5. 选取3条SmGols基因较保守的区域间一段长为90 bp的片段作为RNAi目标片段，以pKannibal为中间载体，pART27为表达载体，通过PCR及限制性内切酶酶切的方法构建SmGols基因的干涉载体，借助根癌农杆菌介导的叶盘法转化丹参。经gDNA水平的PCR检测后，进一步采用RT-PCR结合Real-time qRT-PCR的方法分别检测3条SmGols基因在各转化株系中的表达情况。筛选出干涉效果最明显的3个转基因株系是Gi2-9、Gi2-17和Gi3-16。
6. SmGols干涉株系、PDK株系以及野生型株系在正常培养条件下没有表现出明显的差异，在遭受高盐和低温胁迫后干涉株系植株体内的丙二醛含量相对于野生型和PDK株系有所升高；对植株脱水处理120 min 后，野生型和PDK株系的含水量分别为起始时间点52.23%和49.49%，干涉株系Gi2-9、Gi2-17、Gi3-16的含水量分别为起始点的42.63%，39.21%，37.49%。以上实验结果表明，干涉SmGols基因后会使丹参植株抵抗高盐和低温逆境胁迫的能力下降，会使丹参植株的失水率上升。说明SmGols基因与丹参的耐盐、耐寒和耐旱作用有关。