● 摘要
膜糖蛋白（GP）Ibα是血小板粘附分子GPIb-IX-V复合物中的重要功能亚基，其与受损伤的血管壁表面血管性血友病因子(vWF)的结合是血液中循环血小板粘附到血管壁形成血栓的起始。GPIbα与vWF的结合受vWF构象变化以及GPIbα胞内段与信号分子14-3-3ζ和骨架蛋白肌动蛋白结合蛋白（ABP）的结合所调控。ABP与GPIbα的557-579氨基酸序列结合，使的GPIb-IX-V复合物连接到细胞骨架上，对GPIbα在血小板的表面表达具有重要的作用。14-3-3ζ蛋白是广泛分布在所有真核细胞中的信号分子，与细胞生长、分化和凋亡密切相关。在血小板GPIb-IX-V中存在有多个14-3-3ζ蛋白结合位点，包括GPIbαC端609磷酸化丝氨酸位点，该位点是14-3-3ζ蛋白与GPIb结合的关键位点，该位点的缺失或被封闭将导致14-3-3ζ蛋白和GPIb-IX-V结合的解离，进而抑制vWF与GPIb的结合功能。另一位点是GPIbβ的166位点，该位点丝氨酸磷酸化受蛋白激酶A调控，当其磷酸化时可与14-3-3ζ蛋白结合，对vWF与GPIb-IX-V的结合起负调控作用，还有一个位点存在于GPIbα 580-590序列，其中587和590位点的磷酸化丝氨酸是14-3-3ζ蛋白结合的关键。本研究中，我们分析了GPIbα氨基酸序列，发现557-561序列中包含有一个丝氨酸位点即559位点，该序列与14-3-3ζ配体序列相符，利用合成小分子多肽免疫动物制备抗体技术，成功获得了特异识别559位点丝氨酸磷酸化和非磷酸化的两种抗体，应用此抗体检测发现：在静息血小板中，GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化和非磷酸化两种状态，且磷酸化与非磷酸化含量相当；而在ristocetin诱导聚集的活化血小板中，GPIbα 559位点丝氨酸磷酸化比例增加；同时利用合成的含有GPIbα 559位点丝氨酸磷酸化的557-561序列可穿膜多肽（MP-P）对血小板GPIbα与vWF结合功能影响进行研究，发现MP-P对血小板GPIbα- vWF结合功能有抑制作用，而其对照肽无影响，表明559位点丝氨酸磷酸化对GPIbα-vWF结合功能有调控作用。在体外实验中，MP-P可与14-3-3ζ蛋白结合。用表达GPIbα缺失突变的GPIb-IX细胞株△551和△565对14-3-3ζ和GPIbα胞内段的结合进行研究，结果提示GPIbα559丝氨酸位点是14-3-3ζ蛋白的又一结合位点，该位点对GPIbα-vWF结合的调控功能，可能源于该位点与14-3-3ζ蛋白的结合。因为该位点同时包含在ABP的结合位点557-579序列之内，加入MP-P后对血小板GPIbα与膜骨架结合有促进作用。上述结果表明，在静息血小板中，GPIbα 559丝氨酸位点存在磷酸化状态和非磷酸化两种状态，其磷酸化程度随血小板功能状态而改变；磷酸化的559丝氨酸位点是14-3-3ζ蛋白的结合位点，559丝氨酸的磷酸化程度对GPIbα-vWF结合和GPIbα-ABP的连接有重要的调控作用。