题目：苹果浓缩汁中耐热菌的PCR方法快速检测研究

耐热菌，即酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，是苹果浓缩汁生产中重要的目标控制微生物。耐热菌的耐热性强，能够经受酸性果汁加工中的巴氏杀菌过程而存活；存活下来的耐热菌即使在极低的浓度下，遇到合适的条件，也可在果汁中迅速生长繁殖而导致果汁感官品质的劣变。因此，国际贸易中一般要求每10克苹果浓缩汁中耐热菌的含量小于1。然而，对耐热菌的控制，直至目前仍无成熟可靠的方法。耐热菌超标是苹果浓缩汁生产中最为严重的质量问题之一，也是当前我国苹果浓缩汁行业产品出口中所遭遇的主要的技术壁垒之一，成为果汁生产的"瓶颈"。 耐热菌的有效控制，首先要求其得到快速而准确的检测。目前沿用的耐热菌检测方法为常规的培养检测法，耗时很长，一般需要4~5日才能出检测报告。检测结果的滞后性使之无法及时指导生产，无法及时向生产线反馈信息以采取相应的防范、控制与清洗措施。所以，苹果浓缩汁生产中迫切需要一种快速、准确的耐热菌检测方法。 PCR（聚合酶链反应）是体外快速扩增核酸的方法，它能使极微量的核酸在数小时之内扩增至原来的数百万倍以上。只要选择合适的引物，PCR就可特异性地大量扩增某一DNA片断至易检测水平。利用此原理，可以通过特异性地扩增某种微生物的基因片断而实现快速检测目的。 本实验选择了耐热菌的16S rDNA的高变区V2区和V4区某一段作为特异性引物的接合区域，以实现对此种微生物的特异的快速检测。通过实验研究，确定了苹果浓缩汁中耐热菌的PCR检测方法体系，并对此检测体系作了初步的应用及信度评价；还以此为基础，自制了耐热菌PCR快速诊断试剂盒，并对该试剂盒作了初步研究与应用评价。通过研究得到以下结论： 1．所选用的引物具有良好的种特异性。该引物可使耐热菌（酸土环状脂肪酸芽孢杆菌）特异性地扩增出294bp长度的DNA片断，而对其它近缘或远缘的各菌株都不产生任何扩增片断。 2．通过优化试验，得到本实验的PCR扩增最优化条件：50μL扩增体系中，Taq酶2U、Mg2+浓度2.0mmol/L；最佳退火温度58℃；循环程序为：94℃变性4min后进入PCR循环，94℃30S、58℃30S、72℃30S，扩增35个循环后72℃延伸补足5min。 3．最优化扩增程序下，PCR扩增呈阳性的耐热菌的基因组DNA最低量为1.0pg，PCR扩增呈阳性的最低菌液浓度为5.0×103CFU/mL（水浴法破壁）。 4．为检出苹果汁中低浓度的耐热菌，在PCR反应之前必须进行预培养增殖。最佳预培养条件为：402培养液，pH4.0，45℃通气振荡培养15h。 5．耐热菌DNA最佳提取方法：比较研究了CTAB法、SDS法、水浴法对耐热菌DNA提取率的影响，三种提取方法耐热菌DNA的得率依次略有降低，差别不大；但前两种方法操作过程繁琐，费时较多，而水浴法单管操作，简便快捷。综合考虑，以水浴法提取DNA最佳。 6．成功建立了苹果浓缩汁中耐热菌的PCR快速检测方法。该检测方法整体体系为：10g苹果浓缩汁 → 无菌水适度稀释 → 小滤膜（直径φ25mm，膜孔径0.22μm）针筒式滤器过滤 → 小滤膜转至402培养液中 → 70℃热处理10min → 45℃气浴振荡培养15h → 培养液12000rpm离心10min → 沉淀转入小离心管中 → 水浴法裂解提取DN A → 提取的DNA进行PCR扩增 → 扩增产物凝胶电泳检测→ 结果判断。整个检测过程约需18～20h。PCR法检测结果与KFL常规培养检测法结果完全相符。 7．自制了耐热菌的PCR诊断试剂盒。该试剂盒的信度评价、重复性评价及有效期评价结果表明：其检测结果与常规检测方法结果一致，重复性好，有效期至少为60d（更长的有效期待进一步考察），可考虑实践中的应用。