题目：CCDC152蛋白功能及其表达调控

前言：肿瘤及恶性肿瘤是人类的严重疾病之一。肿瘤的发病机制问题一直是肿瘤研究和治疗的关键。目前，细胞基因突变发生机制与肿瘤细胞代谢已经成为肿瘤防治研究的热点。肿瘤的发生与基因损伤密切相关，肿瘤发生后细胞迅速增殖导致细胞缺氧，肿瘤采用糖酵解方式（Warburg效应）获取大部分的能量，即使氧气含量充足时也是如此。
我们前期研究集中在CCDC152基因非编码区的调控功能,发现CCDC152基因（Coiled-Coil Domain Containing 152）能以3’-非编码区（3’-UTR）与硒蛋白P的 3’-UTR形成天然反义转录结构（Nture Antisense Transcripts，NATs），导致硒蛋白P减少，激活AMPK（Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase），解除硒蛋白P对有氧糖酵解的抑制作用，最终使细胞内Warburg效应增强和脂肪积累。发现CCDC152非编码区具有肿瘤抑制因子p53、转化生长因子（TGF-β1）的调控位点，CCDC152转录受p53的抑制，而TGF-β1具有促进表达的作用。CCDC152的3’端非编码区还可与与某些miRNAs发生作用，该机制也可促进有氧糖酵解现象。
在发现CCDC152基因非编码区具有重要调控功能的同时，CCDC152蛋白的功能仍然未知，所以本实验重点研究CCDC152蛋白功能 。我们对CCDC152蛋白进行结构分析，发现其拥有BRCT结构域（BRCA1 C-terminal region），还是一种收缩蛋白。酵母双杂交实验证明CCDC152蛋白与两种基因损伤修复相关蛋白可以发生相互作用，免疫组织化学分析发现肿瘤组织内CCDC152含量高，而且在细胞核附近聚集，促进核芽、微核形成，推测CCDC152蛋白极有可能参与DDR（DNA Damage Repair）过程。彗星实验证实CCDC152促进DNA损伤修复。我们还发现CCDC152启动子在氯化钴诱导的缺氧细胞中活性升高，蛋白表达量增多，说明CCDC152的表达与缺氧诱导因子HIFs密切相关，很可能参与缺氧诱导应答系统。CCDC152极有可能是DDR系统与低氧应答信号系统联系的桥梁。
研究方法：
1)研究CCDC152调控细胞基因损伤修复系统的机制：首先利用生物信息学手段对CCDC152蛋白结构进行分析，明确其是否拥有与基因损伤修复应答系统密切相关的结构域；然后利用酵母双杂交技术寻找CCDC152能否与基因损伤修复相关蛋白发生蛋白互作；进而免疫组织化学的方法确认CCDC152蛋白在肿瘤细胞内的表达情况初步了解该蛋白与肿瘤细胞的关系；最后构建CCDC152蛋白表达载体，并转染细胞，利用彗星实验探究CCDC152蛋白对紫外照射引起的基因损伤有无明显修复作用。
2)研究CCDC152接受低氧诱导的信号应答系统调控的机制：构建pGL2-CCDC152启动子-luciferase 质粒，瞬时转染进293T细胞，利用氯化钴能够人为制造细胞缺氧环境这一性质，缺氧处理细胞，通过荧光素酶表达检测系统研究缺氧诱导因子HIFs与CCDC152表达的关系；运用Western蛋白印迹检测细胞缺氧状况下CCDC152蛋白的表达量。
结果：
1）对CCDC152蛋白结构进行生物信息学分析，发现该蛋白存在BRCT结构域，该结构域与DDR系统密切相关；酵母双杂交实验结果表明CCDC152蛋白可与基因损伤修复相关蛋白SWS1发生相互作用；免疫组织化学实验发现相比正常组织和细胞，CCDC152蛋白在肿瘤细胞内高表达，而且该蛋白集中出现在肿瘤细胞的细胞核附近，促进核芽、微核形成；彗星实验发现高表达CCDC152蛋白的细胞基因损伤更少，证明CCDC152蛋白具有促进基因损伤修复作用。
2）发现缺氧时，Luciferase酶表达量升高，说明缺氧导致CCDC152启动子活性升高，CCDC152与HIFs具有紧密联系，接受HIF-1调控；Western Blotting 实验发现与正常环境相比，在缺氧环境下CCDC152蛋白表达量明显增多；
结论：
1） CCDC152蛋白具有BRCT结构域，可通过该结构域与DDR相关蛋白相互作用。
2) CCDC152在肿瘤细胞内含量很高，聚集在细胞核附近，参与DDR系统，该蛋白对于减少基因损伤具有重要作用；
3） CCDC152在细胞处于缺氧状态时高表达，可能与缺氧诱导因子HIFs发生紧密联系，接受细胞低氧诱导应答系统的调控；
4) CCDC152蛋白参与DDR系统及低氧诱导应答系统的调控，表明CCDC152与肿瘤的发生与发展密切相关。
本论文综合前期成果后，认为CCDC152利用3’-UTR 的NATs结构及3’-UTR 与miRNAs的互作，增强了肿瘤细胞的Warburg效应。当Warburg效应增强，能够减少线粒体的有氧呼吸，间接减少缺氧环境下活性氧（ROS）的产生量，减少DNA的损伤；CCDC152接受细胞低氧诱导应答系统调控，促进调控细胞基因损伤修复。这一切都表明CCDC152具有减少基因损伤的功能。
本论文在揭示CCDC152蛋白的作用同时，建立了CCDC152参与肿瘤发生发展过程的机制模型，认为CCDC152蛋白是DDR系统与低氧应答信号系统联系的桥梁。